Использование ретровирусных векторов

Использование ретровирусных векторов Преимущество метода, основанного на использовании ретровирусных векторов (рис. 19.1), перед другими методами трансгеноза состоит в его эффективности. Однако размер вставки в этом случае ограничивается 8 т. п. н., вследствие чего трансген может оказаться лишенным прилегающих регуляторных последовательностей, необходимых для его экспрессии. [c.419]

Использование ретровирусных векторов имеет и еще один большой недостаток. Хотя эти векторы создаются так, чтобы они были дефектными по репликации, геном штамма ретровируса (вируса-помощника), который необходим для получения большого количества векторной ДНК, может попасть в то же ядро, что и трансген. Несмотря на все принимаемые меры, ретровирусы-помощники могут реплицироваться в организме трансгенного животного, что совершенно недопустимо, если этих животных предполагается использовать в пищу или как инструмент для получения коммерческого продукта. И поскольку существуют альтернативные методы трансгеноза, ретровирусные векторы редко используются для создания трансгенных животных, имеющих коммерческую ценность. [c.419]

Одна из важных проблем при использовании ретровирусных векторов для генной терапии — их потенциальная опасность. Во-первых, дефектный сам по себе вектор путем рекомбинации с дефектным провирусом-помощником может образовать инфекционный вирус. Во-вторых, не исключена возможность инактивации существенного клеточного гена в процессе интеграции векторной ДНК в хромосому. В-третьих, препарат рекомбинантного вируса может быть загрязнен сопутствующим вирусом. [c.423]

Использование ретровирусных векторов. Трансдуцирующие вирусные векторы имеют одно преимущество, связанное с тем, что инфицирование [c.270]

Ретровирусные векторы, описанные в предпоследней главе, находят сейчас все более широкое применение в практике моле-кулярно-биологических исследований. Мы постарались не погружаться в узкоспециальные проблемы, связанные с ретровирусными векторами, а рассмотреть принципиальные вопросы, касающиеся конструирования и использования подобных систем. [c.9]

Чтобы получить вирусный препарат на основе дефектного по-репликации рекомбинантного ретровирусного вектора, плазмидную ДНК, содержащую провирусную форму рекомбинанта, необходимо ввести в клетки, способные упаковать ретровирусную РНК в вирусные частицы. Для этой цели подходят, например, линии фибробластов, продуктивно инфицированные соответствующим хелперным вирусом — получается вирусный препарат, представляющий смесь рекомбинантного и хелперного геномов (разд. 9.4,2). Альтернативный вариант — использование ретровирусных упаковывающих клеточных линий для получения вирусных препаратов, свободных от хелперных компонентов. [c.287]

Выбор болезни для начала использования генной терапии был хорошо продуман. Ген ADA к этому времени был клонирован его размеры средние он хорошо встраивался в ретровирусные векторы. Ранее при трансплантации костного мозга при у4Ш-недостаточности было показано, что ключевую роль в болезни играют Т-лимфоциты. Следовательно, на эти клетки-мишени должна быть направлена генная терапия. Важным моментом является то, что функционирование иммунной системы возможно при 5—10% уровне >1й/1-белка. Наконец, у4/)/1- генно-инженерные Т-лимфоциты, вероятно, имеют селективное преимушество по сравнению с исходными дефектными клетками. [c.295]

Конструирование векторов на основе ретровирусов. В основе конструирования ретровирусных векторов лежат три важных принципа. Во-первых, векторы должны сохранять последовательности вирусного генома, необходимые для репликации, экспрессии генов и упаковки. Синтез вирусных белков может определяться генами, находящимися в 7и/>йис-положении. Во-вторых, чужеродные сегменты ДНК должны встраиваться в кодирующие области генома или отчасти замещать их. В-третьих, ретровирусные векторы обычно предназначены для использования в качестве трансдуцирующих векторов с упаковкой рекомбинантного генома в вирион. Сами ретровирусы представляют собой природные трансдуцирующие вирусы они рекомбинируют с клеточными геномами и трансдуцируют клеточные гены во вновь инфицируемые клетки как часть провируса. [c.268]

Рис. 19.1. Получение линии трансгенных мышей с использованием ретровирусных векторов. Эмбрион, обычно находящийся на стадии 8 клеток, инфицируют рекомбинантным ретровирусом, несущим трансген. Самки, которым бьи имплантирован эмбрион ( суррогатные матери), производят на свет трансгенное потомство. Для идентификации мьщ1ат, несущих трансген в клетках зародьшгевой лршии, проводят ряд скрещиваний.

Для решения целого ряда задач желательно иметь способ, позволяющий легко выделять рекомбинантный провирус из инфицированных клеток путем молекулярного клонирования. В частности, это относится к использованию ретровирусных векторов для удаления интронов, так как клонирование провируса дает возможность после инфекциононго цикла получать кДНК-копии интересующего нас гена. Кроме всего прочего клонирование провируса наилучшим образом позволяет исследовать и подтвердить генетическую структуру любой ретровирусной конструкции после того, как она претерпела цикл вирусной репликации. Клонирование провирусов включает обычные генноинженерные манипуляции, в том числе создание геномной библиотеки и ее скрининг гибридизационными методами. Однако заметим, что это непростая задача ввиду того, что обычно лишь одна копия искомого провируса присутствует в клеточном геноме. [c.300]

Хотя применение ретровирусных векторов требует, чтобы экспрессируемый ген был введен в соответствующий вектор в строго определенной ориентации (это условие в общем случае ограничивает их использование лишь для хорошо охарактеризованных последоательностей) после того, как правильная рекомбинантная конструкция получена, дальнейшие операции по наращиванию вируса и инфицированию клеток-мишеней технически оказываются достаточно простыми. [c.272]

Цель настоящей главы — очертить рамки практического использования ретровирусов в качестве экспрессирующих векторов общего назначения и описать методы размножения вирусов, тестирования и инфицирования, которые являются общими для большинства процедур, описанных выше. Всех деталей специализированных экспериментов мы касаться не будем. Большинство ретровирусных векторов, описанных на сегодняшний день, ведет свое происхожедние либо от вирусов птиц, либо от вирусов лейкоза мышей (ВЛМ, МЬУ). В данной главе мы сконцентрируем внимание на векторных системах типа МЬУ и экспериментальных процедурах, связанных с использованием этих векторов. [c.274]

Этот подход избавляет нас от необходимости выделять специфический мутант, поскольку он подразумевает использование бактериальных генов, которые дают селективные преимущества при их экспрессии в клетках млекопитающих [28]. Для этого конструируют плазмидные и ретровирусные векторы, в которых бактериальные гены сочетаются с промоторами, местами сплайсинга и сигналами полиаденилирования млекопитающих. Введение бактериальных генов в клетки млекопитающих с по--мощью трансфекции или инфекции приводит к их случайному распределению в геноме реципиента. В качестве примера бактериальных генов, способных обеспечивать селективные преимущества клеток млекопитающих, можно назвать ген Е. oli gpt (он позволяет клеткам-реципиентам утилизировать ксантин в качестве предшественника для биосинтеза пуринов) и генлео (он обусловливает устойчивость клеток млекопитающих к антибиотику G418) [29]. Основной недостаток этого метода — случайное распределение сайтов интеграции однако последние исследования позволяют надеяться, что с помощью гомологичной рекомбинации удастся осуществлять направленную интеграцию. [c.12]

Вирусный способ. Вирусный способ дсстав. и генов эффек-тивег, R силу своей биологичности, поэтому около 80 % испытываемых клинических протоколов основаны на использовании ретровирусных или аденовирусных векторов (см с. 40Я 404). Эти векторы сконструированы на общем подходе вся или большая часть кодирующей последовательности в вирусном геноме заменена экспрессионной кассетой. Манипуляции же с векторами производятся с привлечением специально сконструированных клеток, в хромосомах которых содержится информация, обеспечивающая репликацию векторных геномов и сборку вирионов. [c.422]

Еще одним подходом, дающим надежду на увеличение эффективности переноса генов, является использование в качестве векторов ретровирусов. Основное преимущество этих векторов заключается в том, что они способны эффективно инфицировать большое число различных клеточных типов. Общий вид вирусного вектора, используемого для трансгеноза, изображен на рис. 66. Ретровирусные векторы обеспечивают интеграцию единичной копии трансгена в эмбрионы на разных стадиях развития. Первые эксперименты, продемонстрировавшие внедрение и наследование у мышей экзогенно введенного мышиного вируса лейкемии Молони (MoMLTV), были проведены еще в середине 70-х годов прошлого века Енишем с сотрудниками [c.191]

Ретровирусы обладают рядом уникальных свойств, что обусловило активное использование их в последние годы в качестве молекулярных векторов. Относительно небольшой геном ретровирусов позволяет довольно просто с ним манипулировать и вводить в его состав чужеродные гены. При этом нет жестких ограничений на размер генома, упаковываемого в вирион, и поэтому удается встраивать экзогенные фрагменты ДНК длиной до 10 тпн. Ретровирусная инфекция обычно приводит к стабильной интеграции единственной копии вирусного генома в ДНК клетки-хозяина. Данные вирусы можно легко нарастить в кулыуре клеток до высокого титра. Ретровирусы способны инфицировать как эмбрионы, так и кроветворные клетки, причем эффективность инфицирования очень велика и достигает в эксперименте практически 100 %. Ретровирусы содержат мощные усилители транскрипции, которые обеспечивают высокий 5фОвень экспрессии клонированных генов в клетках различных типов. [c.400]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология