Ретровирусы вектор

Рис. 19.1. Получение линии трансгенных мышей с использованием ретровирусных векторов. Эмбрион, обычно находящийся на стадии 8 клеток, инфицируют рекомбинантным ретровирусом, несущим трансген. Самки, которым бьи имплантирован эмбрион ( суррогатные матери), производят на свет трансгенное потомство. Для идентификации мьщ1ат, несущих трансген в клетках зародьшгевой лршии, проводят ряд скрещиваний.

Рис. 9.5. Геном вируса лейкоза мышей Молоки-ретровируса (РНК-вирус, содержащий ген фермента обратной транскриптазы), ДНК-тран-скрипт которого встраивается в геном млекопитающего и может использоваться в качестве вектора для переноса генов млекопитающих в клетку [2296].

Использование ретровирусных векторов имеет и еще один большой недостаток. Хотя эти векторы создаются так, чтобы они были дефектными по репликации, геном штамма ретровируса (вируса-помощника), который необходим для получения большого количества векторной ДНК, может попасть в то же ядро, что и трансген. Несмотря на все принимаемые меры, ретровирусы-помощники могут реплицироваться в организме трансгенного животного, что совершенно недопустимо, если этих животных предполагается использовать в пищу или как инструмент для получения коммерческого продукта. И поскольку существуют альтернативные методы трансгеноза, ретровирусные векторы редко используются для создания трансгенных животных, имеющих коммерческую ценность. [c.419]

В ретровирусную векторную систему внесены дополнительные усовершенствования увеличено число образующихся вирусных частиц, повышена эффективность трансдукции, осуществлена генноинженерная модификация, обеспечивающая их проникновение в неделящиеся клетки, повышена специфичность инфекции. В последнем случае геном рекомбинантного ретровирусного вектора упаковывается в оболочку другого вируса, белок которой и определяет специфичность связывания ретровируса и спектр [c.493]

Вирусы — они эффективно доставляют ДНК к ядру клетки. Чтобы удалить гены, ответственные за размножение вируса и инфекционность, вектор можно модифицировать методами генной инженерии. В случае мышей бьши успешно использованы ретровирусы, однако пока невозможно проконтролировать, куда встраивается ДНК, и поэтому не исключены хромосомные мутации. [c.264]

Экспертному совету FDA предстоит принять решение о том, как эти неприятные события скажутся на судьбе остальных исследований по генной терапии в США. Американское общество генной терапии также срочно формирует комитет экспертов для проверки всех данных по применению векторов на основе ретровирусов в генной терапии и инженерии (прежде всего — выведении трансгенных [c.134]

Вы познакомились с основными приемами и способами модификации генома микробных, растительных и животных клеток. Для биотехнологии большое значение представляет создание суперпродуцентов на основе микробных и растительных клеток, способных синтезировать любые белковые вещества, имеющие практическое значение. Генная инженерия дает возможность не только создания новых, отсутствующих в природе продуцентов целевых продуктов, но и существенного увеличения эффективности уже существующих производств. Например, способом повышения продуктивности того или иного продуцента является амплификация, т е. увеличение числа копий генов, кодирующих целевой продукт. Можно еще раз подчеркнуть огромные возможности генной инженерии для создания вакцин на основе синтетических антигенов, трансгенных растений с заранее заданными свойствами, а также транс-генных животных. В дополнение следует отметить использование методов генной инженерии в диагностике некоторых заболеваний, например вирусных инфекций, а также для лечения ряда наследственных заболеваний. В связи с этим появился даже новый термин генная терапия. Для лечения наследственных болезней необходимо дефектный ген заменить на нормально функционирующий. В качестве векторов обычно используют РНК-ретровирусы, которые вводятся в стволовые клетки костного мозга. [c.507]

Следующий раздел касается некоторых фундаментальных аспектов биологии ретровирусов, на которых базируется их применение в качестве векторных молекул. Разд. 9.3 дает представление о различных конструкциях ретровирусных векторов. В разд. 9.4—9.6 описаны методы размножения вирусов, инфицирования клеток и тестирования вирусных препаратов. Заключительный, разд. 9.7 касается некоторых практических вопросов, которые следует принимать во внимание при работе с данными векторами. [c.274]

Ретровирусы можно рассматривать как природные векторы для переноса и экспрессии чужеродных генов. Ретровирусы с высокой степенью онкогенности быстро и весьма эффективно вызывают опухоли у млекопитающих и, как правило, способны трансформировать соответствующие клетки в культуре. За одним лишь исключением (разд. 9.3.3), эти вирусы дефектны по репликации, поскольку онкогенные последовательности клеточного происхождения заместили у них те вирусные последовательности, которые кодируют гранс-действующие функции [16]. Вирусные продукты, необходимые для репликации и интегра ции таких дефектных вирусов, обеспечиваются по транс-схеме не- [c.278]

Принимая во внимание непредсказуемое поведение некоторых новых ретровирусных конструкций (разд. 9.7), как правило, имеет смысл проверять структуру и экспрессию рекомбинантных ретровирусов с помощью анализа их ДНК и РНК, а также путем прямой детекции экспрессируемых белковых продуктов (если, конечно, это возможно). Для векторов, не экспрессирующих примечательный фенотип, такого рода молекулярный анализ особенно важен. [c.299]

Ретровирусные векторы имеют тот серьезный недостаток, что все они генетически нестабильны. Это может проявляться либо в форме массированных делеций, которые легко обнаруживаются с помощью блот-гибридизационного анализа, либо в виде точ-ковых мутаций, которые труднее детектировать и потому они более коварны. По всей видимости, РНК-полимераза и обратная транскриптаза, реплицирующие вирусный геном, не обладают сколько-нибудь заметной корректирующей активностью и частота спонтанных мутаций у ретровирусов необычайно высока [14, 20]. По имеющимся оценкам, частота мутирования ретровирусных векторов достигает 0,5% в расчете на каждый цикл [c.304]

Для получения ретровирусного вектора полноразмерную ДНК ретровируса встраивают в плазмиду, с помощью эндонуклеазного расщепления удаляют большую часть гена gag и гены pol и env, оставляя 5 "-концевой участок гена gag и 5 - и 3"-LTR, а затем рядом с / -областью встраивают терапевтический ген, транскрипция которого будет контролироваться 5"-LTR-промотором при необходимости можно встроить и маркерный селективный ген с собственным промотором (рис. 21.3). Такая конструкция позволяет экспрессировать оба клонированных гена, На основе этой схемы созданы различные ретровирусные векторы. Максимальный размер ДНК-вставки, которую может переносить ретровирусный вектор, - примерно 8 т. п. н. [c.488]

В пакующей клеточной линии не образуются компетентные по репликации ретровирусы дикого типа, способные встраиваться в гены и приводить к некотролируемой пролиферации некоторых клеток (т. е. к превращению их в раковые клетки). Это весьма существенно, особенно если частицы ретровирусного вектора предполагается использовать для геной терапии соматических клеток человека. В качестве меры предосторожности все же проводят регулярное тестирование готовых ретровирусных векторов, с тем чтобы выявить ретровирусы дикого типа. Кроме того, в пакующей клеточной линии нуклеотидные последовательности ретровируса и вектора локализованы в трех разных областях хромосомы, что делает весьма маловероятной возможность последовательных рекомбинационных событий, которые могли бы привести к образованию компетентного по репликации ретровируса. [c.489]

Вопрос о применении геной терапии всегда вызывал споры, но большинство ученых согласны с Т. Фридманом и Р. Роблином, которые еще в 1972 г. (S ien e 175 949-955) писали Мы считаем, что геная терапия сможет облегчить симптомы некоторых наследственных заболеваний человека, поэтому необходимо продолжать исследования, направленные на ее развитие. Ключевые моменты генной терапии — адресная доставка терапевтического гена и обеспечение его экспрессии в определенных клетках или тканях. Сначала в качестве основного средства доставки терапевтических генов рассматривали векторы, полученные на основе вирусов человека. Это было связано с наличием у них механизмов проникновения в специфические foieTKH. Наиболее многообещающими считали векторы на основе ретровирусов. Но нативный ретровирус - это инфекционный агент, который по- [c.492]

Перенос рДНК в клетки прокариот или введение последовательностей клонированной ДНК в рецепторные эукариотические клетки (например, млекопитающих) с помощью фаговых векторов называют трансфекцией Альтернативный метод — использование вирусов эукариот, то есть когда эукариотическая клетка инфицируется — (заражается) вирусом В качестве векторов при этом чаще используют литические вирусы типа вируса полиомы и SV40, а также челночные векторы, сконструированные на основе ретровирусов и папилломавирусов [c.202]

Как уже было сказано в начале этого раздела, другим методом получения трансгенных животных (в частности, мышей) является заражение предимплантированных эмбрионов рекомбинантными ретровирусами, которые оказались удобными объектами для этих целей. Геном ретровирусов сравнительно небольшой и с ним относительно легко манипулировать, вводя в него чужеродные гены ретровирусы достаточно инфекционны в отношении пермис-сивных клеток (почти 100% заражение их), а единственна копия ретровирусного генома ДНК прочно и строго определённым образом интегрируется с ДНК клетки-мишени и эти последние способны экспрессировать привнесенные вирусом гены. Уровень экспрессии клонированных генов заметно повышается вследствие того, что в ретровирусах имеются весьма активные транскрипционные энхасеры, или усилители (см.). Известные ретровирусные векторы ведут свое происхождение от вирусов лейкоза мышей (MLV) или от вирусов птиц (ALV). [c.584]

Из одиннадцати пациентов доктора Фишера девятерых мальчиков (включая двоих, у которых теперь обнаружили лейкемию) лечили этим способом, причем их самочувствие при постоянном контроле все время было отменным. Когда поступило сообш ение о первом случае лейкемии, многие специалисты сочли это простым совпадением. Но доктор К. фон Калле из детской больницы Цинциннати (штат Огайо, США) отмечает, что анализ клеток в обоих случаях свидетельствует, что рак вызван, по всей вероятности, одним и тем же молекулярным сбоем молекулярный вектор (биологический переносчик) на основе ретровируса, использованный для доставки корректирующего гена в организм пациента, внедрился в тот участок его ДНК, где находится печально известный ген LM02, способный, по мнению специалистов, вызывать лейкемию у детей. Ученые сегодня убеждены — болезнь, признаки которой обнаружены у обоих мальчиков, настолько напоминает лейкемию, что пока решено классифицировать ее именно так. По оценкам доктора фон Калле, вектор локализуется рядом с геном LM02 с вероятностью примерно 10 т. е. дефектной оказывается по крайней мере одна из 100 тыс. клеток. А поскольку каждый из пациентов при таком методе лечения получал около миллиона скорректированных клеток, ясно, что некоторые из них могли оказаться дефектными . Фон Калле провел тщательное исследование анализов всех пациентов, которых лечили подобным образом (во всем мире их 15 человек), пытаясь обнаружить присутствие дефектных клеток. [c.134]

Гельсингера, наступившей в результате генной терапии с применением аденовируса (вызывающего обычные ОРЗ) как средства доставки лечебного гена. А теперь епде более грозная и неприятная сенсация — лейкоз у двух детей, лечившихся в Европе от врожденного иммунодефицита. В этих испытаниях вектором, т. е. биологическим переносчиком, служила конструкция на основе ретровируса. В отличие от большинства векторов (как вирусной, так и другой природы) ретровирусы внедряются в геном реципиента — видимо, именно с этим и связано возникновение лейкоза. [c.137]

Ретровирусы (лейковирусы) — семейство РНК-содержащих вирусов, встречающихся у человека и животных в генной инженерии используются как векторы. [c.192]

Поскольку геномная РНК ретровирусов претерпеэает сплайсинг, интронные последовательности, введенные в сойтав ретровирусного вектора, могут точно выщепляться из вирусного генома. Следовательно, путем клонирования провирусной ДНК после инфицирования с помощью ретровирусных векторов можно получать полноразмерные кДНК-копии генов среднего размера [И, 12]. [c.274]

Цель настоящей главы — очертить рамки практического использования ретровирусов в качестве экспрессирующих векторов общего назначения и описать методы размножения вирусов, тестирования и инфицирования, которые являются общими для большинства процедур, описанных выше. Всех деталей специализированных экспериментов мы касаться не будем. Большинство ретровирусных векторов, описанных на сегодняшний день, ведет свое происхожедние либо от вирусов птиц, либо от вирусов лейкоза мышей (ВЛМ, МЬУ). В данной главе мы сконцентрируем внимание на векторных системах типа МЬУ и экспериментальных процедурах, связанных с использованием этих векторов. [c.274]

Мы рассмотрим лишь некоторые аспекты жизненного цикла ретровирусов, представляющие интерес в данном контексте — а именно те, которые имеют отношение к специфичности круга хозяев ретровирусных векторов. Круг хозяев ретровируса дикого Tina можно ограничить как на внеклеточг10Й, так и на внутриклеточной стадии его жизненного цикла [151. При этом особого внимания заслуживает внеклеточная стадия, включающая взаимодействие белков вирусной оболочки с поверхностными клеточными рецепторами. [c.277]

Векторы с внутренним промотором лишены тех недостатков сплайсинг-векторов, которые связаны с вероятностью неадекватного сплайсинга (разд. 9.7). Однако ретровирусы дикого типа не содержат внутренних промоторов, поэтому данные векторы могут давать неудовлетворительную экспрессию клонированных генов вследствие неблагоприятного взаимодействия промоторов (даже однонаправленных) [23, 24]. Как бы то ни было на практике векторы с внутренним промотором хорошо себя зарекомендовали во многих случаях и приобретают все большую популярность. [c.283]

Описано несколько различных упаковывающих клеточных линий для получения чистых препаратов ретровирусных векторов семейства MLV [17, 19, 21, 32]. Из них наиболее широкое применение нашли, пожалуй, линия ij)2 [17], упаковывающая вирусную РНК в экотропные частицы (т. е. такие, которые способны инфицировать только клетки мыши и крысы), и линия РА 317 [32], позволяющая получать амфотропные препараты с широким кругом возможных хозяев, практически не содержащие хелперных вирусов. Известны также упаковывающие клетки для векторов на основе ретровирусов птиц [33]. [c.288]

Несмотря на то что использование ретровирусов в качестве векторов основано на обширном знании биологии природных ретровирусов, в вопросах, связанных с репликацией и экспресси- [c.301]

Векторы для спаренных генов с внутреннйм промотором не эксплуатируют вирусную систему сплайсинга. Однако нередко и они не могут обеспечить эквивалентную экспрессию обоих генов. Кроме тех случаев, когда LTR или внутренний промотор оказываются неспособными эффективно функционировать в инфицируемых клетках конкретного типа, экспрессия любого маркера может подавляться также вследствие неблагоприятного взаимодействия двух промоторов. Эмерман и Темин [23], работая с вектором, содержащим внутренний промотор, обнаружили, что селекция, направленная на экспрессию 5 -гена, вызывает эпигенетическую супрессию З -промотора и наоборот. Хотя Э шт эффект, зависящий от специфического сочетания используемых промоторов, по-видимому, наиболее ярко проявляется в векторах, основанных на ретровирусах птиц, он также свойствен я векторам, принадлежащим к семейству MLV [24]. [c.304]

Одной ИЗ ВОЗМОЖНЫХ причин делеций в ретровирусных геномах служит аномальный сплайсинг вирусной РНК. Хотя в MLV-векторах сигнал для упаковки расположен ниже вирусного донорного сайта сплайсинга (относительно направления транскрипции), так что молекулы, претерпевшие сплайсинг с участием именно этого сайта, неспособны упаковываться в вирусные частицы, криптические сайты сплайсинга, присутствуюш,ие во вставке, способны вызывать нежелательные последствия. Делеции и перестройки могут происходить также в результате рекомбинационных событий с участием эндогенных мышиных ретровирусных последовательностей, рекомбинации в процессе трансфекции или же ошибок при обратной- транскрипции и интеграции [14]. Кроме всего прочего в некоторых случаях делеции могут неумышленно отбираться при селекции на экспрессию определенного маркерного гена. Примером этого может служить эксперимент (табл. 9.7), демонстрирующий особенности сплайсинг-вектора для спаренных генов рМХ 1122/иг/с. пео в присутствии последовательности с-тус ингибируется сплайсинг вирусной РНК (разд. 9.7.1). Несмотря на низкую эффективность трансфекции, обнаруживаемую, этим вектором при селекции на устойчивость к G418, трансфицированные клетки активно продуцировали пео-трансдуцирующий вирус (табл. 9.7). Однако последующий анализ показал, что эти вирусные частицы несут делецию с-тус (М. Скотт, Г. Вармус, неопубликованные данные). Следовательно, селекция на эффективную экспрессию гена neo привела к утрате последовательностей с-тус, ответственных за ингибирование образования субгеномной лео-мРНК- Высокая частота делеций, обусловливающая повышенный уровень экспрессии селективного маркера, также свойственна и векторам с внутренним промотором, однако пока такие данные получены только для векторов на основе ретровирусов птиц [41]. [c.305]

Инфицирование предимплантированных эмбрионов рекомбинантными ретровирусами — относительно несложная процедура, не требующая дорогостоящего оборудования. Тем не менее любой интересующий ген необходимо сначала переклонировать в вирусный вектор и эту рекомбинантную конструкцию ввести в соответствующие клетки, чтобы получить клеточную линию, продуцирующую инфекционные рекомбинантные вирусные частицы. Здесь, однако, следует иметь в виду, что размер вставки, которую способен акцептировать вирусный вектор, ограничен (около 10 т. п. н.) кроме того, интересующая ДНК может содержать [c.309]

Исследуются и возможности использования ДНК для лечения наследственных заболеваний. В настоящее время усилия в этой области направлены на встраивание ДНК нормальных генов в соматические клетки, такие, как клетки костного мозга (генная терапия). В последние годы осуществляются эксперименты in vitro и на животных, где в качестве векторов для введения генов используются ретровирусы. До весны 1985 года такие исследования на людях не проводились. Более ранние попытки осуществления генной терапии для лечения аргининемии с использованием вируса папилломы Шоупа и Р-талассемии с использованием Р-глобиновых генов были преждевременными и не дали клинического эффекта. Применение генной терапии половых клеток, то есть встраивание нормальных генов в дефектные половые клетки, оплодотворенные яйцеклетки или эмбрионы [c.33]

Перенос генов с помощью вирусов основан на природном процессе вирусной инфекции. Эффективные векторы созданы на основе хромосомной ДНК ретровирусов, вирусов SV40, аденовирусов, аденоассоциированных вирусов, вируса вакцины, вируса герпеса и др. Ретровирусные векторы используются особенно часто для переноса генов в клетки животных [212]. [c.150]

Инфекция клеток ретровирусами хотя и не вызывает их гибель, но и не безразлична для них. Провирус инактивирует ген, в который он интегрировался, и может активировать соседний с ним клеточный ген с помощью своего энхансера или транскрипции с промотора, находящегося в правом LTR. Подобная незапрограмми-рованная конститутивная экспрессия клеточного гена может привести к неконтролируемому делению клеток, если продукт гена каким-то образом влияет на их размножение. К такому же эффекту могут привести и мутации в некоторых генах. Подобные измененные гены называют клеточными онкогенами с-опс), а их исходные аллели — протоонкогенами. Онкоген может оказаться и в составе вирусного генома. Вирусные онкогены v-on ) имеют своих гомологов среди клеточных генов, но в отличие от них не содержат интроны. Очевидно, что они произошли от мРНК клеточных (прото)он-когенов, а онкогенные вирусы выступают в этом случае как природные векторы-переносчики генов. У разных вирусов гены v-on внедряются в различные участки вирусного генома (рис. 2.7,г) и часто вызывают их дефектность. Такие вирусы могут размножаться только в присутствии родственных недефектных вирусов. [c.54]

Использование транспозонов. Перенос генов с помощью транс--1030ННЫХ векторов, как и в случае использования ретровирусов, еет определенные преимущества. Здесь интеграция генов про-сходит с использованием сайт-специфических транспозаз, что т сохраняет чужеродные гены от перестроек и делает экспрес- ю и регуляцию внесенных генов более контролируемой. [c.417]

На основании результатов экспериментов по введению онкогенов в составе плазмидных векторов в первичные эмбриональные фибробласты крысы было впервые сформулировано представление о том, что для полной морфологической трансформации нормальных клеток требуется кооперация онкогенов по крайней мере двух типов. Один из них должен принадлежать к онкогенам ядерного типа, т. е. к онкогенам, продукт которых локализован в ядре и взаимодействует либо с ДНК ядра, либо с ядерным матриксом. К онкогенам ядерного типа относятся с-тус, с-туЬ, с-тИ, имеющие аналоги среди ретровирусных трансформирующих последовательностей, и белок р-53 клеточного происхождения, аналогов которого у ретровирусов нет. В группу онкогенов неядерного типа попадает большой класс онкогенов, кодирующих тирозинзависимые протеинкиназы — с.- агс, .- 68, -fgr, с-уез, с-гоз, с-аЫ группа онкогенов, кодирующая рецепторы для ростовых факторов (с-егЬ-В, с.-1т8), и сами ростовые факторы с.-з18, В-1ут1) онкогены семейства с-га5, кодирующие ГТФ-связывающие белки. Выделяют также группу онкогенов, которые к настоящему времени слабо охарактеризованы — с-за, Т-1ут/, с-ге1. [c.226]

Еще одним подходом, дающим надежду на увеличение эффективности переноса генов, является использование в качестве векторов ретровирусов. Основное преимущество этих векторов заключается в том, что они способны эффективно инфицировать большое число различных клеточных типов. Общий вид вирусного вектора, используемого для трансгеноза, изображен на рис. 66. Ретровирусные векторы обеспечивают интеграцию единичной копии трансгена в эмбрионы на разных стадиях развития. Первые эксперименты, продемонстрировавшие внедрение и наследование у мышей экзогенно введенного мышиного вируса лейкемии Молони (MoMLTV), были проведены еще в середине 70-х годов прошлого века Енишем с сотрудниками [c.191]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология