Тест связывания

Таблица 12-1. Тест связывания с использованием мышиных ГеМ-антител, очищенных осаждением

Идентификация рецептора основана на следующих предпосылках необходимо иметь лиганд (эндогенный или экзогенный), в который можно ввести радиоактивную метку этот лиганд должен иметь достаточно высокое сродство к рецептору, чтобы его можно было точно измерить при тесте связывания, и такое связывание должно быть специфичным для данного рецептора. Специфичность такого рода определяют также три критерия [c.242]

Клоны с гибридными клетками в лунках можно увидеть через 14—18 или даже через 28 дней после слияния. После того как зарегистрировано образование клонов, можно отбирать из лунок образцы надосадочной жидкости. Для проведения одного теста связывания нужно 25 мкл культуральной жидкости. Обычно готовят все необходимое для одновременного скрининга 100—200 образцов. Надосадочные жидкости из лунок с быстро растущими клонами обычно тестируют через 18 дней, а из лунок с более медленно растущими клонами — через 21—28 дней после слияния. [c.182]

Природный токсин стрихнин (рис. 9.21) оказался полезным пнструментом для выделения и биохимической характеристики глицинового рецептора. Его [Ш] производное имеет сродство, достаточно высокое для того, чтобы его можно было использовать в тестах связывания рецепторного белка (7 0=11,3 нМ), а иммобилизация стрихнина на аффинной колонке позволила Бецу и сотр. очистить рецептор, солюбилизированный тритоном, Б 1000 раз за одну стадию. Более того, будучи фоточувствитель-ным соединением, стрихнин оказался и без химической модификации удобной фотоаффинной меткой. УФ-облучение комплекса стрихнина и рецептора приводит к ковалентному мечению только одного полипептида (М 48 ООО). [c.295]

Описанный в этой главе метод основывается на том, что клетки гибридом способны включать радиоактивную экзогенную метку в синтезируемые ими белки. Очищенные антитела стабильны и специфически связываются с любой клеткой-мишенью, живой или убитой, если эта клетка несет антигены, узнаваемые данными антителами. Тест связывания антител надежен, достаточно гибок и хорошо воспроизводим. Он позволяет получать количественные данные, причем результаты регистрируются автоматически. Примеры использования этого метода, приведен- ые в данной главе, полностью относятся к исследованиям аллоантигенов мышей, однако подобный подход применим ко всем типам клеток, для которых имеются соответствующие моноклональные антитела. [c.217]

Для того чтобы тест связывания с антителами был эффективным, а фон неспецифического связывания.—низким, необходимы чистые препараты меченых антител. Большая часть мышиных IgG связывается с белком А. Эти иммуноглобулины могут быть, легко очищены на колонке с иммобилизованным белком А. Получаемые при этом чистые препараты антител характеризуются очень низким уровнем неспецифического связывания. Мышиные IgM и крысиные иммуноглобулины проще всего высаливать,, однако получаемые при этом препараты содержат примеси. [c.221]

Ротавирусы кур, индюков, уток и других птиц дают перекрестные реакции со всеми серотипами реовирусов млекопитающих [62]. Всего выделено 77 штаммов реовирусов птиц. Все они дают перекрестные реакции по тесту связывания комплемента и преципитации в агаре и разделяются на пять серотипов по результатам реакции нейтрализации [142, 143]. [c.268]

С применением немеченых конкурирующих лигандов. Препараты, в которых более 90% радиоактивности входит в состав специфически взаимодействующих антител, могут быть использованы в равновесных тестах связывания для измерения плотности антигена и констант сродства (Faze as de St. Groth, 1979). Иногда измеряют количество несвязанной радиоактивности в супернатанте после центрифугирования, а равновесные условия поддерживают за счет уменьшения числа промывок. [c.230]

Аликвоту суспензии гибридных клеток, позитивных по тестам связывания, ресуспендируют в 0,5 мл среды МСИД (5-j-lO-10 клеток). [c.184]

Эффективность преципитации буфером с низкой ионной силой, к сожалению, варьирует в значительной степени. Для многих IgM формируются осадки, содержащие почти всю активность антител. Из этих осадков получают препараты антител, дающие удовлетворительные результаты в тестах связывания (табл. 12-1), правда, не такие хорошие, как в случае IgG. Этим способом можно эффективно очищать также некоторые крысиные моноклональные антитела субкласса IgG2. Простота про- [c.224]

Таблица 12-2. Результаты теста связывания при исследовании экспрессии новых типов Н-2-антигенов в трансфецированных фибробластах

Описанный метод был применен для детектирования новых антигенов на фибробластах, трансфецированных клонированными Я-2-генами (табл. 12-2). Мы обычно используем этот метод для Н-2- и 1а-типирования стимулированных Кон-А спленоцитов, которые также применяются как клетки-мишени для цитотоксических Т-клеток. Очень удобно, что эти клетки можно оставлять на холоду в течение ночи перед проведением теста связывания (табл. 12-3). Для стандартного Н-2- и 1а-типирова-ния мышей-беккроссов мы хирургически удаляем два или четыре шейных лимфатических узла и готовим клеточную суспензию. Эту суспензию можно разделить как минимум на пять порций в зависимости от набора моноклональных антител, которые будут использоваться для тестирования (если ожидают результат о наличии или отсутствии антигена, то нет необходимости считать клетки) (табл. 12-4). [c.228]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология