Аффинные колонки

РЕГЕНЕРАЦИЯ И ХРАНЕНИЕ АФФИННЫХ КОЛОНОК [c.279]

Каким образом можно получить белок, оставшийся на аффинной колонке, в чистом виде Объясните, какие принципы лежат в основе предлагаемой операции. [c.163]

На каждом этапе колоночной хроматографии содержание белка в смеси увеличивается не более, чем в 20 раз. и поэтому выделить из сложной смеси белков отдельный белок за один цикл практически невозможно. На долю каждого белка, как правило, приходится менее 1/1000 всего белка клетки, и для его очистки требуется последовательное использование нескольких различных типов колонок (рис. 4-47). Гораздо более эффективен метод аффинной хроматографии (хроматография но сродству). В основе этого метода лежат биологически важные взаимодействия, происходящие на поверхности белковых молекул. Так, при ковалентном связывании субстрата фермента с матриксом, например, с полисахаридными шариками, фермент специфически удерживается матриксом и может быть элюирован (смыт) практически в чистом виде. Подобным образом можно иммобилизировать короткие олигонуклеотиды ДНК определенной структуры (см. разд. 4.6.8) и использовать подобные носители для очистки ДНК-связывающих белков, опознающих данную последовательность нуклеотидов на хромосомах (см. разд. 9.1.8). С матриксом можно связать и специфические антитела такой носитель очень удобен для очистки белков, узнаваемых этими антителами. Аффинные колонки обладают высокой степенью специфичности за один цикл хроматографии можно добиться очень высокой степени очистки (1000-10000 раз). [c.213]

Экстракты, выделенные, как описано в разд. 5.3.2 (п. 2, 3 или 4), могут быть непосредственно нанесены на аффинные колонки, содержащие антитела к -галактозидазе без какого-либо предварительного фракционирования (например, удаления нуклеиновых кислот). Поэтому гибридные белки, характеризующиеся низкой стабильностью или низким содержанием в клетке, могут быть легко выделены из разбавленных экстрактов без деградации, возможной при более длительных методах выделения. [c.157]

Таблица 5.8. Подготовка аффинной колонки с иммобилизованными гибридными белками

Регистрируя оптическую плотность белкового материала с помощью соединенного с колонкой высокочувствительного спектрофотометра, нанесите еще раз фракцию диализованных антител, полученных на стадии 4, на аффинную колонку с иммобилизованной -галактозидазой, уравновешенную PBS для удаления возможных примесей антител к -галактозидазе. Теперь фракция, сходящая с колонки, должна содержать только антитела к чужеродному фрагменту гибридного белка. [c.168]

Определение структуры гликопротеинов требует (как и в случае других молекул) их предварительной очистки, которая может быть достигнута с помощью методов, обычно применяемых для белка. Для очистки некоторых гликопротеинов оказалось весьма плодотворным также применение аффинных колонок с лектинами (см. ниже). Углеводный состав гликопротеинов определяли после кислотного гидролиза при помощи газожидкостной хроматографии—масс-спектрометрии (ГЖХ—МС). Для изучения детальной структуры олигосахаридных цепей было опробовано множество различных методов. Наиболее эффективной оказалась комбинация ГЖХ—МС и ЯМР-спектрометрии с высоким разрешением. Особенности связей между сахарами в гликопротеинах (рассмотрение которых не входит в задачу данной главы) имеют фундаментальное значение для структуры и функций этих молекул. [c.300]

Концентрация лиганда может быть использована для тонкого регулирования связывания макромолекулы с аффинной колонкой. Концентрация лиганда, выбранная на основании отдельного эксперимента, вероятнее всего, не будет оптимальной для достижения наилучшего разделения. Это особенно относится к адсорбентам, содержащим фенилборную кислоту. В этих случаях должны быть поставлены несколько экспериментов с различными концентрациями лиганда для окончательного решения вопроса об условиях разделения. [c.104]

Значительное влияние на многие биоспецифические взаимодействия оказывает изменение pH и температуры. В случаях когда связывание фермента проявляет заметную рН-зависи-мость (не совпадающую с рН-оптимумом активности), можно ожидать, что кривые элюирования с аффинной колонки будут обнаруживать эту рН-зависимость. [c.109]

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЦИЛИНДРИЧЕСКИХ ПЕРЕГОРОДОК В КРУПНОМАСШТАБНЫХ АФФИННЫХ КОЛОНКАХ [c.122]

Важное условие зональной аналитической аффинной хроматографии состоит в том, что концентрация подвижного компонента [Р] по мере прохождения зоны через слой адсорбента постоянно изменяется. Поэтому члены, содержащие [Р], не включаются в выражения, относящиеся к объемам элюирования и константам диссоциации (см., например, приведенные выше уравнения). Пренебрежение [Р] допустимо только в том случае, если этот параметр мал по сравнению с константой диссоциации /Сь- Проведение экспериментов по зональному элюированию при низком [р] обычно легко осуществимо и особенно желательно при анализе труднодоступных биомолекул. Использование низких [Р] в зональном анализе аналогично применению низких концентраций фермента в твердофазном ферментативном кинетическом анализе [7]. Было экспериментально показано (например, в работе [5]), что при низком (по отношению к /Сх) количестве фермента, введенного в аффинную матрицу, рассчитанные константы диссоциации практически не зависят от количества использованного подвижного компонента. В то же время в работе [8] предложены уравнения расчетов по методу постоянного элюирования/фронтального анализа, в которые входит точное значение концентрации подвижного компонента, нанесен ного на аффинную колонку (см. также гл. 6). С практической точки зрения метод зонального элюирования экспериментально более удобен и требует гораздо меньшего количества подвижного компонента. Таким образом, зональное элюирование, по-видимому, наиболее подходящий метод для изучения большинства взаимодействий, представляющих биологический интерес. Следовательно, существует необходимость в чувствительных аналитических методах для проведения элюирования и детектирования малых количеств подвижного компонента. [c.223]

СИД водорода, образующийся после введения глюкозы в аффинную колонку. При времени инкубации менее 30 мин достигнута чувствительность 10-12 - 10-15М, [c.215]

В препарате МКА (даже в виде асцитной жидкости) фактически все молекулы иммуноглобулина представляют собой антитела нужной специфичности в отличие от препарата поликлональных антител, в котором самое большее 20% молекул иммуноглобулина, а зачастую и намного меньше имеют необходимую специфичность. Это значит, что, используя МКА, можно приготовить аффинные колонки очень высокой емкости, пусть даже не достигающие теоретически возможной (см. ниже). [c.165]

Рис. 5.3. Устройство системы аффинных колонок

Аффинные колонки и скорость хроматографии [c.176]

Природный токсин стрихнин (рис. 9.21) оказался полезным пнструментом для выделения и биохимической характеристики глицинового рецептора. Его [Ш] производное имеет сродство, достаточно высокое для того, чтобы его можно было использовать в тестах связывания рецепторного белка (7 0=11,3 нМ), а иммобилизация стрихнина на аффинной колонке позволила Бецу и сотр. очистить рецептор, солюбилизированный тритоном, Б 1000 раз за одну стадию. Более того, будучи фоточувствитель-ным соединением, стрихнин оказался и без химической модификации удобной фотоаффинной меткой. УФ-облучение комплекса стрихнина и рецептора приводит к ковалентному мечению только одного полипептида (М 48 ООО). [c.295]

I - з часток для амплификации ДНК соответствующей продукту синтеза 2 - рандомизованный фрагмент 3 - участок для амплификации ДНК 4 - аффинная колонка с иммобилизованным лигандом а - афинная хроматография и элюция б - обратная транскрипция а - амплификация I - транскрипция [c.307]

I - 5 -концевой фрагмент донорной РНК 2 - рандоми-зоБанный фрагмент РНК 3 - акцепторный олигонуклеотид 4 аффинная колонка с иммобилизованным олигонуклеотидом, комплементарным 5 -концу акцепторного алигонукпеотида . 5 - праймер для амплификации ДНК, соответствующий продукту синтеза 6 - праймер для амплификации участка ДНК, кодирующего донорный рибо-олигонуклеотид, снабженный промотором для Т7 РНК-полимеразы [c.308]

Автолизат (45 мг) растворялся в 5,0 мл 0,03 М трИс-НС1-буфера (pH 7,3) и наносился на аффинную колонку (200X25 мм). Для элюирования использовался 0,03 М трис-НС1-буфер (pH 7,3) скорость потока 160 мл/ч объем фракции 10 мл. Гликан, пептид и фрагменты пеп-тидогликана выходили в пике I. Тейхоевая кислота удерживалась на колонке. В момент, указанный стрелкой, добавляли раствор 0,05 М а-метил-О-глюкозы в 0,03 М трис-НС1 (pH 7,3), и тейхоевая кислота выходила в виде пика П. / — оптическая плотность при 280 нм [c.121]

Рис. 6.9. Аффинная хроматография солюбилизированных детергентом рецепторов инсулина мембран клеток печени на аффинных колонках, содержащих дн-аминодипропиламиносукцинил-Ы-фенилаланил—инсулин—агарозу [8].

Основные положения теории клональной селекции получили убедительные подтверждения. Например, если лимфоциты животного, которое не было иммунизировано, инкубировать в пробирке с любым из несколькггх меченых антигенов, например А, В, С и В, то только очень малая доля (<0,01%) лимфоцитов будет связывать данный антиген Это означает, что лишь немногие клетки несут специфические рецепторы для А, В, С или В. Такую интерпретацию подтверждает другой эксперимент. Антиген А делают столь высокорадиоактивным, что любая связавшая его клетка получает летальную дозу облучения оставшаяся после этого популяция лимфоцитов уже не способна реагировать на антиген А, в то время как она продолжает нормально реагировать на В, С и В. Тот же эффект можно получить, если наполнить аффинную колонку (разд. 4.4.3) стеклянными шариками, покрытыми антигеном А, а затем пропускать через эту колонку лимфоциты. В таком опыте клетки с рецепторами для А связываются с шариками, тогда как остальные клетки проходят через колонку клетки, прошедшие через колонку, не взаимодействуют более [c.221]

Размер гетерологичного белкового фрагмента — важный параметр при клонировании гибридных белков, содержащих -галактозидазу. Стабильность (а следовательно, и выход) гибридных белков, как правило, снижается при увеличении размера чужеродного фрагмента. Во многих случаях желательно, чтобы в состав гибридных белков входили короткие фрагменты. Для получения специфических антител вполне достаточными оказываются фрагменты гетерологичной ДНК, кодирующей антиген длиной всего 200 п.н. [16]. Вместе с тем использование коротких фрагментов может привести к тому, что при небольшой относительной массе чужеродного полипептида (по сравнению с массой -галактозидазы) титр специфичных к чужеродному белку антител у иммунизированных животных окажется низким. Аффинная очистка антител в этом случае также менее эффективна вследствие низкой емкости аффинных колонок, в которых связанные с носителем гибридные белки несут короткие гетерологичные фрагменты. Один из путей решения этой проблемы состоит в увеличении молярного соотношения гетерологичный фрагмент -галактозидаза в гибридном белке. Это достигается пришиванием к гену la Z множественных тандемных копий гетерологичного фрагмента ДНК. На рис. 5.5 приведены сравнительные результаты клонирования и экспрессии одной из пяти копий кодирующего фрагмента гена ftz Drosophila в pUR291. Выход гибридного белка, кодируемого одной копией этого гена, примерно в десять раз превышает выход белка, кодируемого пятью тандемными копиями. [c.147]

Аффинная колонка с гибридным белком (иммобилизованные на сефарозе молекулы анти-р-гаяак-тозидазы, сшитые с помощью ДМП с гибридным белком) [c.164]

Для определения количества специфичных к гибридному белку антител, присутствующих в сыворотке, и для получения препарата антител, не загрязненного антителами к -галактозидазе, антисыворотку к гибридному белку сначала наносят на аффинную колонку, содержащую иммобилизованную -галактозидазу. Для подготовки такой колонки используют 5—7 мг очищенной -галактозидазы Е. oli (Sigma) диализованной против PBS. Метод подробно приводится в табл. 5.6. [c.165]

Антитела выделяют, как описано в табл. 5.7. Поскольку фракция антител, специфичных к геторологичному фрагменту гибридного белка не связывается с колонкой, ее собирают без значительных потерь, промывая колонку PBS. Элюируемая фракция антител, специфичных к -галактозидазе, служит хорошим контролем в опытах, где используются антитела к гибридным белкам, и может применяться для приготовления аффинных колонок для выделения гибридных белков (см. ниже). [c.165]

Следующий этап эксперимента — это выделение белка на аффинных колонках, содержащих соответствующую ДНК, Этот этап необычайно труден, так как содержание белков, узнающих специфические последовательности ДНК, исключительно низкое. Между тем выделение белка пока является необходимым этапом как для изучения его биологической активности, так и для последующего клонирования, для которого надо или иметь антитела к белку, или знать последовательность какого-либо из его пептидов. Тогда можно выявить соответствующий клон либо иммунологически, либо гибридизацией с химически синтезированной олигонуклеотидной пробой. [c.168]

Изящный вариант каскадной методики такого типа был продемонстрирован недавно на примере выделения цитрат-син-тетазы (К. Ф. 4.1.3.7) и фумаразы (К. Ф. 4.2.1.2) с использованием одной и той же аффинной колонки, содержащей пиромел--литовую кислоту (ПМК), присоединенную к сефарозе 4В через пространственную группу диаминопропанола. Экстракт ткани наносят на колонку с ПМК-сефарозой 4В в 0,01 М фосфатном буфере (pH 7,3), содержащем 0,01 М меркаптоэтанол. Цитрат-синтетаза сорбируется полностью, в то время как связывание фумаразы в присутствии фосфата подавляется (фосфат — конкурентный ингибитор этого фермента). Цитрат-синтетазу элюируют тем же буфером, содержащим 0,01 М лимонную кислоту. Полученный элюат наносят на колонку с гелем голубой сефарозы 4В, где фермент связывается количественно, и далее элюируют 0,01 М фосфатным буфером (pH 7,3), содержащим меркаптоэтанол (но не содержащим лимонной кислоты). Фракцию фумаразы, не сорбированную на ПМК-сефарозе 4В в условиях элюирования фосфатом и содержащую 100% ферментативной активности, подвергают диализу против 0,01 М трис-ацетатного буфера (pH 7,3), содержащего 0,014 М меркаптоэтанол и наносят на колонку с ПМК Сефарозой 4В в указанном буфере. При этом наблюдается количественное связывание фермента, элюирование которого проводят в присутствии ь-яблочной кислоты и далее, после удаления последней, фумаразу сорбируют на колонке с голубой сефарозой, а затем проводят элюирование, вновь добавляя яблочную кислоту в рабочий трис-ацетатный буфер. [c.190]

На рпс. 5.2 приведен простой способ изготовления аффинной колонки tja основе обыкнове(пюго шприца объемом 5 мл. Стенки шприца обрабатывают ацетоном, резиновый наконечник поршня используют в качестве верхней насадки. Перед заполнением колонки аффинным сорбентом (3 мл) на слой стекловолокна помещают 2 мл сефадекса G-25 среднего размера. Слои сефадекса препятствует смешиванию аффинного сорбента со стекловолокном. [c.191]

Температура оказывает заметное влияние на емкость аффинных колонок. При повышенных температурах уменьшается степень удерживания дрожжевой алкогольдегидрогеназы и глицерокиназы на N -(6-аминогексил)-5 -АМР-сефарозе. Однака глицерокиназа может количественно связываться при этих по- [c.110]

Электростатические взаимодействия играют важную роль в связывании ферментов на аффинных колонках, поскольку увеличение ионной силы (увеличение концентрации соли в элюирующем буфере) обычно приводит к десорбции связанных ферментов с аффинных адсорбентов различных типов. Однако для некоторых ферментов в присутствии соли увеличивается прочность связывания, например, в результате гидрофобных взаимодействий, обусловливающих сорбцию интерферона фибро-бластов [15], интерферона кролика [16] и изоцитратдегидроге-назы из сердца человека [17] на иммобилизованном цибакроне голубом З-ОА. В таких случаях при увеличении ионной силы элюента белки не элюируются с колонки и для их десорбции необходимо применение таких элюентов, как 50%-ный (об./об.) зтиленгликоль. [c.112]

Исторически сложился следующий экспериментальный при- м для элюирования использовались буферы с увеличивающейся ионной силой. Незначительные экономические затраты являются весьма веским преимуществом такого метода элюирования. Во многих работах для увеличения ионной силы описано использование КС1 или Na L Эффективность использования различных солей для элюирования с иммобилизованных красителей и, возможно, с других аффинных колонок оценивалась с помощью коэффициентов вязкости В. С помощью предлагаемых в работе [19] таблиц можно изменять ионную силу элю-<ента в соответствии с пиком элюирования белка таким образом можно влиять на кривые элюирования, меняя состав и концентрацию соли. [c.116]

Применение моноклональных антител для иммуноанализа пептидов требует большой осторожности, поскольку высокоспецифичные моноклональные антитела могут взаимодействовать, например, только с одним из изогормонов. По этим же причинам нельзя использовать слишком специфичные моноклональные антитела и для аффинной очистки пептидов. Кроме того, существует опасность разрушения образца при его элюировании с аффинной колонки под действием pH и ионной с ы раствора. И наконец, следовые количества антител могут загрязнять очищенный продукт и влиять на результаты анализа. [c.35]

Использование микрокомпьютерной системы управления позволяет совершенствовать метод аффинной хроматохрафии. Свойства аффинных колонок после каждого цикла меняются, как бы точно ни выполнялись условия очистки. Поэтому система управления, основанная на регистрации времени или объема, не может реагировать на такие изменения. Высокая стоимость аффинных колонок, особенно белка А, а также ценность получаемых моноклональных антител требуют включения в систему управления приборов, реагир)пющйх на любые отклонения и неполадки. Например, применение датчиков на воздух позволяет предотвратить высушивание колонки при прекращении подачи раствора, а использование клапанов давления перед входными фильтрами предотвращает разрушение системы, если колонка забьется. [c.49]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология