Терминирующие реакции

Пожалуй, единственным недостатком генетически модифицированной Т7 ДНК-полимеразы является ее низкая термостабильность. Причем, этот недостаток становится заметен лишь при секвенировании G -богатых последовательностей за счет формирования участков с сильной вторичной структурой. Для преодоления этого недостатка встречались рекомендации увеличить концентрацию фермента и несколько повысить температуру инкубации (до 45 °С) при проведении терминирующих реакций. И то и другое в отдельных случаях способствовало нормальному прохождению ферментом таких сложных участков. Однако участки с сохраняющейся при этой температуре вторичной структурой были неразрешимы. Становилось очевидным, что для определения нуклеотидных последовательностей с высоким содержанием ОС-пар необходимо использование термостабильных ферментов. [c.91]

Терминирующие реакции с использованием ревертазы [c.148]

Как уже отмечалось в самом начале данной главы, в отдельных случаях очень трудно отнести тот или иной процесс к определенному типу ПЦР-секвенирования ДНК. Хотя, следует сказать, что в последнее время стали появляться работы, в которых описываются процессы, когда действительно происходит накопление продуктов секвенирующих (терминирующих) реакций и одновременное экспоненциальное увеличение числа амплифицируемых и секвенируемых молекул. [c.152]

Стандартным буфером для нанесения образцов ДНК на секвенирующий гель служит добавляемый в терминирующие реакции в виде стоп-раствора формамид с маркерными красителями-ксиленоловым голубым и бромфеноловым синим, имеющими различную подвижность. Данные красители в полиакриламидных гелях разной концентра- [c.177]

Кроме биологических праймеров, в литературе встречается упоминание о праймерах, как бы синтезируемых самой ДНК-полимеразой в процессе удлинения исходного праймера [Speek et al., 1986]. Данные праймеры представляли собой некий гибрид синтетического универсального праймера (о котором речь пойдет ниже) и биологического. Так, в результате построения второй цепи ДНК Кленовским фрагментом ДНК-полимеразы I с использованием в качестве затравки универсального праймера образовывались двуцепочечные участки ДНК, протяженность которых зависела от времени инкубации. После этого предлагалось, зная рестриктазную карту клонированного фрагмента ДНК, расщеплять вновь построенный двуцепочечный участок соответствующими рестрикционными эндонуклеазами и уже далее проводить непосредственно само секвенирование в виде терминирующих реакций. Следует отметить, что о подобном подходе говорилось и ранее [Godson, 1980], но в силу своей трудоемкости и плохой воспроизводимости он не нашел широкого распространения. [c.60]

Главное отличие циклического секвенирования ДНК от большинства описанных в предыдущем разделе, пожалуй, заключается в особенностях проведения терминирующих реакций. Так, прямое секвенирование фрагментов ДНК, полученных в ходе ПЦР, может проводиться с помощью любой ДНК-полимеразы, включая и нетермостабильную секвеназу. Причиной тому служит весьма значительное количество матрицы ДНК, позволяющей осуществить ее детекцию в секвенирующем геле. А ПЦР в данном случае просто служит для наработки необходимого количества сначала двуцепочечной, а затем и одноцепочечной ДНК. Секвенирование же ДНК с помощью так называемой линейной ПЦР осуществляется посредством циклических этапов денатурации, отжига одного праймера и удлинения цепи в условиях ее терминации дидезоксинуклеотидами, причем последние присутствуют в смеси, начиная с первого цикла (рис. 3.7). Ввиду того, что в этих случаях происходит амплификация ДНК только в арифметической прогрессии (не приводящая даже к образованию полноразмерных продуктов), то исходным материалом, несущим изначально довольно большое число копий секвенируемого фрагмента, может служить, например, ранее клонированная ДНК. С помощью всего 30 циклов становится возможным получение такого количества продуктов реакции амплификации/терминирования, которое уже будет видно после электрофоретического разделения в секвенирующем геле. [c.152]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология