Рестриктазы рестрикционные эндонуклеазы III

Рис. 4.60. Обнаружение глобинового гена. ДНК выделяют из любого препарата клеточных ядер, в ее составе имеются глобиновые гены. Различные рестрикционные эндонуклеазы (рестриктазы) расщепляют ДНК на множество фрагментов (рестриктов), узнавая специфические последовательности нуклеотидов. Фрагменты разделяют по размеру с помощью гель-электрофореза. Готовят специфический радиоактивный зонд на глобиновый ген и гибридизуют его с фрагментами ДНК Радиоактивный сигнал обнаруживают с помощью радиоавтографии [1252].

Механизмом, предотвращающим смешивание генетического материала прокариот разных видов, служат процессы рестрикции и модификации ДНК, осуществляемые соответствующими ферментами. Рестрикционные эндонуклеазы (рестриктазы) расщепляют проникшую в клетку чужеродную ДНК. Они распознают специфические нуклеотидные последовательности и разрезают по ним или рядом с ними двухцепочечные молекулы ДНК. Модифицирующие метилазы клетки обеспечивают метилирование оснований своей ДНК в участках, чувствительных к рестриктазам. Модифицированные таким путем участки становятся устойчивыми к действию рестриктаз. (В противном случае молекула ДНК расщеплялась бы собственными рестриктазами.) Таким образом, процессы модификации и рестрикции обеспечивают защиту собственной ДНК от проникшего в клетку чужеродного генетического материала. [c.133]

Фрагменты, содержащие концы вставок перенесенной ДНК и обладающие вследствие этого лишь частичной гомологией с рестрикционным фрагментом векторной плазмиды. По определению пограничные фрагменты содержат ДНК как вектора, так и растения, а их размер зависит от расстояния ближайшего к границе сайта узнавания используемой рестриктазы внутри перенесенной ДНК до первого такого сайта в окружающей ее ДНК растения. Обычно пограничные фрагменты в геле обладают иной подвижностью, чем фрагменты исходной ДНК плазмидного вектора, обработанные той же эндонуклеазой. При одинаковой подвижности, интенсивность полосы будет ниже, чем ожидается для внутреннего фрагмента, поскольку пограничный фрагмент состоит не только из последовательностей ДНК вектора. [c.314]

Разрезание ДНК на фрагменты Любая нативная ДНК может быть "измельчена" с помощью ферментов эндонуклеаз, среди которых особое место занимает рестриктазы (рестрикционные эндонуклеазы) Биологическая роль их, например, в клетках прокариот заключается в гидролизе чужеродной ДНК, проникающей в клетки извне Собственная хромосомная ДНК при этом остается незатронутой рестриктазами, что обусловлено наличием ферментов, называемых моди-фикационными мети-лазами, узнающими одинаковые с рестриктазами сайты Названные метилазы катализируют реакции метилирования А или Ц в немногих специфических сайтах в хромосомах, в результате чего метилированная ДНК оказывается нечувствительной к атаке рестриктазами Переносчиком метильных групп выступает S-адено-зил-Ь-метионин (SAM) [c.188]

Рестриктаза (рестрикционная эндонуклеаза) — фермент бактериального происхождения, распознающий специфическую нуклеотидную последовательность длиной от 4 до 10 пар нуклеотидов и разрезающий двунитевую молекулу ДНК в этом месте. [c.356]

Первые наблюдения. Заражая фагом X различные штаммы Е. соН, Арбер [296] обнаружил, что ДНК этого фага при пассаже через бактерию разрезается и теряет свою инфекционность. Оказалось, что ни классические рекомбинационные процессы, ни мутации в этом не участвуют. Более того такая судьба постигала не только фаговую но и любую чужеродную ДНК, попадаю щую в бактерию. Такое разрезание (реет рикцию) следует рассматривать как защит ный механизм клетки. Как было показано в дальнейшем, рестрикция чужеродной ДНК осуществляется ферментами, называемыми рестрикционными эндонуклеазами (рестриктазами). Встает вопрос, почему ре-стриктазы не разрезают ДНК собственной клетки. Ответ был найден Арбером и состоял в следующем. Эти ферменты вступа- [c.123]

Рестрикционные эндонуклеазы — важнейший "инструмент" для выполнения генно-инженерных работ. Часть производимых рестриктаз приведена в таблице 20. [c.460]

В основе метода, позволившего непосредственно приступить к манипуляциям с генами, лежит открытие ферментов, названных рестрикционными эндонуклеазами (рестриктазами). Еще в 1953 г. было обнаружено, что ДНК определенного штамма Е. соИ, введенная в клетки другого штамма (например, ДНК штамма В в клетки штамма С), не проявляет, как правило, генетической активности, так как быстро расщепляется на фрагменты ДНК-специфическими ферментами — рестриктазами. К настоящему времени из разных микроорганизмов выделено более тысячи различных рестриктаз. В генетической инженерии наиболее широко используются около 200. [c.25]

Добавьте избыток рестриктазы к пробирке № 1, содержа щей аликвоту 40 мкл. Мы обычно используем 2 мкл рестрикционной эндонуклеазы в концентрации 10—20 ед./мкл (за 1 ед. [c.44]

Этот первый метод выделения генов был разработан в конце 1960-х — начале 1970-х гг. Его появление стало возможным благодаря открытию ферментов, называемых рестрикционными (от англ. restri ting — ограничивающий) эндонуклеазами или рестриктазами. Эти ферменты обнаруженные в бактериях, способны разрезать ДНК, например они разрезают любую вторгающуюся в бактериальную клетку вирусную ДНК, ограничивая (рестрицируя) таким образом размножение вирусов внутри клетки. Разные виды бактерий продуцируют различные рестрикционные эндонуклеазы. Каждая из них разрезает нуклеиновую кислоту (отсюда, нуклеаза ) в строго определенных точках ( эндо означает, что фермент разрезает молекулу изнутри, а не атакует ее с концов). Фермент распознает некую последовательность оснований и взаимодействует именно с ней. Точки разрезания называются сайтами рестрикции. К настоящему времени выделено более 2000 рестриктаз, активных в отнощении 230 разных последовательностей. Свою собственную ДНК бактерия защищает путем присоединения к определенным основаниям в сайтах рестрикции метильной группы. [c.219]

Рестриктазы класса II. Системы рестрикции-модификации класса II состоят из отдельных белков рестрикционной эндонуклеазы и модификационной метилазы. Поэтому рестриктазы данного класса можно выделить в индивидуальном состоянии, свободном от метилазной активности, что в значительной мере упрощает их изучение и последующее использование для расщепления молекул ДНК. [c.16]

TOB из геля. Поскольку метод химической деградации требовал довольно больших количеств ДНК, а элюция из полиакриламидного или агарозного гелей не очень эффективна, то разработка многочисленных векторов, несущих сайты для клонирования по многим рестрикционным эндонуклеазам, позволила, основываясь все на том же рестриктаз-ном картировании, расщеплять вставку подходящими ферментами и получать необходимые субклоны в подобном векторе и затем их секвенировать в составе этого же вектора, получая меченные по одному концу фрагменты ДНК, как описано выше. [c.237]

В настоящее время рестриктазы подразделяют на три класса с )гчетом RMS-системы, в которой RMS — белки рестрикции, метилирования (модификации) и посадки соответственно К первому из них относят те рестриктазы, которые расщепляют ДНК в произвольных точках с образованием различных фрагментов ДНК (для обеих нитей ДНК известны системы R2M2S), ко второму классу (их известно около 500) относят ферменты, для которых сайты рестрикции и посадки совпадают — RS и MS Образующиеся при этом фрагменты (рестрикты) воспроизводятся по длине Рестриктазы этого класса, объединяющие рестриктазы вышеуказанных трех групп, преимущественно использзшэтся на практике Рестриктазы III класса (например из фага Р1, системы 2R MS) объединяют все прочие рестрикционные эндонуклеазы Отдельные из них, например, не узнают сайтов посадки Их редко используют на практике [c.189]

Рестрикция (разрезание) выделенной из клеток ДНК осуществляется ферментами — рестрикционными эндонуклеазами (рестриктазами). Эти ферменты вступают в реакцию с определенными участками ДНК, так называемыми сайтами узнавания, которые в клетке обычно бывают защищены специальными группировками (метилированы). После обработки ДНК эндонуклеазами фрагменты имеют так называемые липкие концы рестрик-тазы разрезают две цепи ДНК не в одном месте, а в двух разных местах, в результате чего одна из цепей оказывается длиннее другой на несколько нуклеотидов. Свободные нуклеотиды мо1ут спариваться с комплементарны.ми нуклеотидами другого фрагмента ДНК с липкими концами. Благодаря этому, ДНК из различных источников может объединяться, образуя рекомбинантные молекулы. Это свойство рестрикционных фрагментов ДНК ис-нoль yeт( я в генной инженерии для со 1дания искусственных векторов на основе бактериальных плазмид, или фагов. [c.67]

Основным требованием при использовании рестриктаз в генно-инженерных и других молекулярно-генетических экспериментах является функциональная чистога, а именно, отсутствие примесей неспецифических нуклеаз и фосфатаз. Поэтому, основные усилия при выделении и очистке рестрикционных эндонуклеаз направлены на получение функционально чистых их препаратов. Однако, для структурно-кинетических исследований эндонуклеаз рестрикции требуются относительно больщие количества гомогенных препаратов ферментов. Несмотря на то, что как уже отмечалось, в настоящее время охарактеризовано (и в большинстве случаев выделено) более 1000 рестриктаз, лишь небольшая их часть получена в го(могенном состоянии. [c.66]

Рестрикционные эндонуклеазы П-го типа являются гидрола-зами, специфически взаимодействующими с определенными короткими нуклеотидными последовательностями двухцепочечной ДНК и расщепляющими фосфодиэфирную связь в определенном месте относительно участка узнавания. Несмотря на то, что в настоящее время известно более 1000 рестриктаз, и более ста среди них широко используются в качестве аналитических реагентов, кинетика и механизм реакций катализируемых этими ферментами изучены недостаточно. С чем это связано Во-первых, в большинстве экспериментов обычно используется избыток эндонуклеазы рестрикции, чтобы обеспечить полное расщепление ДНК, поэтому не требуется знания определенных кинетических параметров фермента. Во-вторых, для изучения кинетики реакций ДНК с эндонуклеазами рестрикции, используются довольно сложные и относительно длительные количественные методы регистрации каталитической активности рестриктаз, например, разделение рестрикционных фралментов ДНК электрофорезом в агарозном или полиакриламидном геле с последующим определением относительного количества продуктов УФ-сканированием геля, окрашенного бромистым этидием (или фотонегатива этого геля) или подсчетом радиоактивности фрагментов при использовании меченной ДНК (разд. 1, часть II). [c.68]

В завершении обсуждения биологического подхода следовало бы подчеркнуть, что он в принципе неприемлем для целенаправленного поиска рестриктаз II типа. Этим способом отбираются СХС без учета их энзиматической основы. Как известно, в ограничении развития фагов участвуют и рестрикционные эндонуклеазы I и III типов. Поэтому неизбежным этапом идентификации типа и субстратной специфичности рест-риктирующего компонента обнаруженной новой СХС является его исследование биохимическими методами. [c.135]

В случае использования биологических методов, как следует из приведенных выше примеров, огромное число штаммов исключается из круга исследуемых уже на первых стадиях проверки. Биохимической проверке доступны все штаммы. Однако, и в этом случае существует множество причин, по которым имеющиеся в клетках специфические эндонуклеазы могут быть не обнаружены. Вряд ли все их можно предусмотреть и перечислить. Среди Очевидных причин видимого отсутствия искомой активности (кроме упомянутого выше отсутствия сайтов узнавания в субстрате) в опытах in vitro можно перечислить следующие отсутствие сайтов узнавания может иммитироваться природными модификациями субстратов как в виде метилирования, так и более сложными ее вариантами [19, 155]. Предположительно часть рестриктаз может инактивироваться в ходе получения бесклеточных экстрактов или маскироваться присутствием большой, относительно рестриктазной, активностью неспецифических нуклеаз. Несмотря на исключительно высокую чувствительность электрофоретического метода [241],. из-за маскирующего действия нуклеаз она может только снизиться. Проявление последнего фактора особенно должно сказаться на обнаружении рестриктаз, содержащихся в клетках в незначительных количествах. Состав рестрикционных смесей,, используемых для определения активности рестриктаз в опытах по их поиску, может оказаться далеко не оптимальным. В ка- [c.140]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология