ДНК рестриктазные карты

Все рассмотренные выше стратегии секвенирования протяженных фрагментов ДНК методом Максама-Гилберта нельзя отнести к стратегиям случайного подхода, так как они основывались, как правило, на знании рестриктазной карты клонированного фрагмента ДНК и были рассчитаны на получение конкретных субфрагментов ДНК или субклонов. В то же время возможность случайного раздробления крупного фрагмента ДНК физическими методами и получение на их основе субклонов для их последующего секвенирования методом химической деградации принципиально возможны, хотя и не производительны. При этом, однако, необходимо отметить, что совершенствование векторных систем и их использование для определения нуклеотидных последовательностей протяженных фрагментов ДНК химической деградацией по Максаму-Гилберту не смогло значительно повысить производительность этого метода, разве что, кроме, метода мультиплексного секвенирования. [c.237]

Кроме биологических праймеров, в литературе встречается упоминание о праймерах, как бы синтезируемых самой ДНК-полимеразой в процессе удлинения исходного праймера [Speek et al., 1986]. Данные праймеры представляли собой некий гибрид синтетического универсального праймера (о котором речь пойдет ниже) и биологического. Так, в результате построения второй цепи ДНК Кленовским фрагментом ДНК-полимеразы I с использованием в качестве затравки универсального праймера образовывались двуцепочечные участки ДНК, протяженность которых зависела от времени инкубации. После этого предлагалось, зная рестриктазную карту клонированного фрагмента ДНК, расщеплять вновь построенный двуцепочечный участок соответствующими рестрикционными эндонуклеазами и уже далее проводить непосредственно само секвенирование в виде терминирующих реакций. Следует отметить, что о подобном подходе говорилось и ранее [Godson, 1980], но в силу своей трудоемкости и плохой воспроизводимости он не нашел широкого распространения. [c.60]

Секвенирование больших фрагментов ДНК методом химической деградации по Максаму-Гилберту было возможно путем построения подробной рестриктазной карты клонированного фрагмента ДНК, разработки на ее основе стратегии секвенирования, заключающейся в выборе тех или иных рестриктазных фрагментов исследуемого клона, полностью перекрывающих всю длину вставки (рис. 8.1). Далее следовал этап препаративного расщепления ДНК соответствуюпщми рестрикционными эндонуклеазами, препаративный гель-электрофорез, концевое мечение элюированных фрагментов и проведение реакций химической модификации и гидролиза. Следует отметить, что данный подход к секвенированию крупных вставок методом Максама-Гилберта вполне может быть применен и в настоящее время, однако разработ- [c.234]

Рис. 8.1. Стратегия секвенирования протяженного фрагмента ДНК методом химической деградации, основанная на знании детальной рестриктазной карты

Отсутствие необходимости предварительного рестриктазного картирования протяженной вставки является важным преимуществом стратегий случайного подхода и позволяет экономить много времени и усилий на данном этапе, а также и на этапе лигирования, который проводится только один раз со всем множеством получаемых мелких фрагментов ДНК. Поскольку для получения серии подобных субклонов фрагментация ДНК осуществляется произвольным образом или с помощью ферментов, или физическим воздействием, то знания рестриктазной карты совершенно не требуется. Однако клонирование таких случайных фрагментов приводило, подчас, к многократному секвенированию одних и тех же участков ДНК, что имело, впрочем, некоторое положительное значение, увеличивая достоверность нуклеотидной последовательности ДНК ввиду ее многократного прочтения , да еще и в обоих направлениях. В то же время отдельные фрагменты иногда никак не удавалось субклонировать и секвенировать. [c.240]

Недавно для получения субклонов для секвенирования было предложено использовать рестрикционные эндонуклеазы IIS-типа, причем генерирующие фрагменты ДНК с 5 выступающими нуклеотидами на 5 -конце [Rena, Houslay, 1998]. По мнению авторов, данные уникальные последовательности, образуемые этими 5 нуклеотидами, позволят осуществить правильную состыковку секвенируемых субклонов, не прибегая к построению детальной рестриктазной карты всего фрагмента ДНК. [c.247]

Другой подход к завершению определения нуклеотидной последовательности клонированного фрагмента ДНК заключается в целенаправленном субклонировании конкретного участка исходного клона. Достичь этого можно, построив с помощью компьютера рестриктазную карту секвенированных областей вставки, основываясь на ставшей уже известной последовательности нуклеотидов части секвенируемого фрагмента ДНК, что, возможно, позволит определить необходимые рестрикционные эндонуклеазы для субклонирования нужного фрагмента. [c.247]

При определении последовательности нуклеотидов протяженных фрагментов ДНК направленным подходом получение субклонов носит упорядоченный характер, иногда основанный на знании рестриктазной карты клонированного фрагмента ДНК, В связи с этим состыковка секвенированных фрагментов не представляет каких-либо сложностей, так как заранее известно, какое место вставки подвергается секвенированию. Уменьшается и общее число прочитанных нуклеотидов, что позволяет удешевить проект по секвенированию протяженного фрагмента ДНК. [c.248]

Наиболее оптимальным является получение в составе исходного вектора субклонов, различающихся размером делетированных участков вставки между сайтом какой-либо подходящей полилинкерной рестрикционной эндонуклеазы, предшествующим сайту клонирования (со стороны отжига секвенирующего праймера) и прогрессивно удаляющимися местами вставки. Однако большинство вариантов направленного подхода, предполагающего получение серии таких субклонов, укороченных с одного конца вставки, различаясь значительно при проведении делеционных процедур, требуют первого этапа рестриктазного картирования с целью или построения подробной рестриктазной карты секвенируемого фрагмента ДНК, или обнаружения подходящих рестрикционных эндонуклеаз, отсутствующих во вставке, которые могут быть затем использованы для получения необходимых субклонов. [c.249]

Хотя при осуществлении этого подхода с ДНКазным расщеплением и не требуется построения детальной рестриктазной карты клонированного фрагмента ДНК, все же необходимо владеть информацией об отсутствии сайтов расщепления используемых полилинкерных рестрикционных эндонуклеаз во вставке, поскольку в противном случае результатом будет гетерогенная смесь, в которой будет чрезвычайно трудно разобраться. [c.250]

Геном ЗУДО, С наружной стороны карты приведены условные генетические единицы, с внутренней - число пар оснований. Указаны уникальные рестриктазные сайты, Участки, кодирующие пять вирусных белков, вынесены за пределы карты. Заметьте, что большой Т-анти-ген кодируется двумя отдельными группами генов (см, гл. 8). [c.262]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология