Амплификация с помощью полимеразной цепной реакции

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)—это метод амплификации in vitro, с помощью которого в течение нескольких часов можно выделить и размножить определенную последовательность ДНК в количестве, превышающем исходное в 10 раз [1, 2]. Такая высокая степень направленного обогащения значительно упрощает использование имеющегося образца ДНК-Некоторые области применения ПЦР высокоэффективное клонирование геномных последовательностей [3], прямое секвени-рование митохондриальной и геномной ДНК [5—7, см. ниже], анализ вариаций нуклеотидных последовательностей [8] и выявление вирусных патогенов [9—И]. [c.176]

Открытие возможности избирательной амплификации определенных участков ДНК с помощью полимеразной цепной реакции [Saiki et al., 1985, 1988] оказало чрезвычайно сильное влияние на всю молекулярную биологию, включая и секвенирование ДНК. До появления этого метода можно было секвенировать только рекомбинантные молекулы ДНК (кроме некоторых частных случаев). Причина этого кроется в низком содержании в геноме какой-либо определенной, даже повторяющейся, последовательности и невозможности детекции столь малого количества фрагментов ДНК при их секвенировании. Теоретически можно было бы детектировать на радиоавтографе секвенирующего геля полосы ДНК какого-нибудь условного гена, если взять в реакцию около 500 мг тотальной ДНК с ее концентрацией в реакционной смеси приблизительно 50 г/мл. Поскольку такое принципиально невозможно, то для определения последовательности нуклеотидов было необходимо использовать ДНК, обогащенную каким-либо геном или просто определенным участком, что и достигалось ранее посредством клонирования. В связи с достаточной сложностью методов клонирования получение таких рекомбинантных ДНК и их последующее секвенирование было доступно далеко не всем не молекулярно-биологическим лабораториям. Амплификация же определенных фрагментов ДНК с помощью специфических праймеров, приводящая за короткий промежуток времени к наработке значительных количеств нужных участков ДНК, явилась мощной и доступной альтернативой методу клонирования. Таким образом, многие лаборатории, ранее и не помышлявшие о секвенировании ДНК ввиду сложности подготовительных этапов, стали активно использовать этот метод в своих исследованиях. Поэтому можно смело предположить, что удельный вес ПЦР-секвенирования в общем определении нуклеотидных последовательностей различных ДНК будет несомненно возрастать. Что касается тех, кто и так раньше владел методами секвенирования ДНК, то они также взяли на вооружение метод ПЦР-секвениро-вания и занялись разработкой его различных модификаций, рассмотрению которых и будет посвящена данная глава. [c.134]

Таблица 1. Реагенты для амплификации -глобинового гена человека при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР), проводимой вручную

Полимеразная цепная реакция, ПЦР (Polymerase hain rea tion) Метод амплификации специфического сегмента ДНК с помощью термостабильной ДНК-поли-меразы с использованием олигонуклеотидных ДНК-зондов, комплементарных последовательностям противоположных цепей ДНК, фланкирующим амплифицируемый сегмент. Процесс состоит из серии циклически повторяющихся реакций денатурации ДНК, отжига зондов, синтеза ДНК. [c.557]

С разработкой метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) появилась еще одна возможность получения меченного по одному концу фрагмента ДНК. Так, если предварительно один из праймеров пометить с помощью полинуклеотидкиназы и меченного у-АТФ, то при амплификации нарабатываемый фрагмент ДНК будет нести метку на одном из 5 -концов [Ohara et al., 1989]. Однако при наличии нескольких различающихся продуктов ПЦР необходим этап повторной амплификации с выделенным из геля фрагментом ДНК, предназначенным для секвенирования. Естественно, в этом случае первая амплификация проводится с немеченными праймерами и только во время повторной один из праймеров должен быть меченым. В то же время можно проводить реакции химической деградации с мечеными фрагментами ДНК, выделенными из геля, не прибегая к повторной амплификации [Tahara et al., 1990 Gal, 1996]. [c.32]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология