Молекулярная гибридизация

Так как при денатурации нуклеиновых кислот их первичная структура сохраняется, то данный процесс может иметь обратимый характер. На способности нуклеиновых кислот восстанавливать свою нативную конформацию после денатурации (ренативация) основан чрезвычайно важный метод определения степени гомологичности, или родственности, нуклеиновых кислот. Этот метод называют молекулярной гибридизацией. Сущность этого метода (рис. 8.15) сводится к следующему сначала смешиваются растворы ДНК, вьщеленных из организмов разного вида (например, лягушки и кролика) затем эти растворы нагревают (для денатурации ДНК), а потом охлаждают. При этом возникают двухспиральные структуры разного состава наряду с двухспиральными молекулами, идентичными исходным ДНК, могут образовываться гибридные ДНК, содер- [c.283]

Краткое описание методов молекулярной гибридизации ДНК и их оценка даны в приложении. [c.84]

В настоящее время молекулярная гибридизация, или гибридологический анализ, является одним из методов идентификации первичной структуры при сравнительном изучении ДНК разного происхождения. Усовершенствование этого метода позволит применить его для выявления генеалогии и уточнения классификации организмов. [c.10]

В настояшее время для диагностики вирусных растений используют иммуноферментную технику, моноклональные антитела, метод молекулярной гибридизации меченых фрагментов РНК- и ДНК-вироидов и вирусов с вирусами тестируемого объекта. Эти методы очень чувствительны, но трудоемки и дорого-стояши. [c.199]

На чем основан метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот и какое значение он имеет для биологических исследований [c.288]

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГИБРИДИЗАЦИЯ И АМПЛИФИКАЦИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ [c.260]

Во всех случаях эффективным экспресс-методом диагностики является выявление вирусной РНК в материале от больных с помощью ПЦР и молекулярной гибридизации. Вирусную РНК обнаруживают с первых суток инфицирования. [c.305]

В молекулярной биологии широко используется способность денатурированных ДНК ренатурировать с восстановлением исходной двуспиральной структуры. Она лежит в основе метода молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот, который позволяет выявлять степень сходства различных ДНК (а также РНК). Для этого денатурированную ДНК (если изучается гибридизация двух различных нуклеиновых кислот, то одна из них несет радиоактивную метку) помещают в условия, оптимальные для образования двойных спиралей (ионная сила раствора — около 0,2 температу за — на 10—20 "С ниже Тт нативной ДНК). В случае полностью комплементарных цепей ДНК со временем они целиком превратятся в двуспиральные молекулы. Если в смеси присутствуют как комплементарные, так и некомплементарные цепи ДНК, то после ренатурации первых тем или иным способом определяют долю двуспиральных молекул. В настоящее время широко распространены методы, когда денатурированные молекулы ДНК одного типа закрепляются на нитроцеллюлозных фильтрах, которые затем помещают в раствор ДНК (или РНК) другого типа. После образования двуспиральных комплексов на фильтрах они легко могут быть отмыты от несвязав-шейся ДНК- Этот же подход используется при выявлении цепей ДНК (или РНК), комплементарных другим ДНК (или РНК), после разделения их электрофорезом в гелях. [c.30]

Однако нуклеотидный состав ДНК — признак в основном крупномасштабный, кроме того, могут встречаться случайные совпадения состава ДНК у далеко отстоящих родов, поэтому большое внимание в монографии уделяется методу молекулярной гибридизации ДНК применительно к целям систематики. [c.4]

III. Определение степени гомологии последовательностей ДНК с помощью методов молекулярной гибридизации [c.133]

В монографии рассматриваются особенности различных методов молекулярной гибридизации ДНК — ДНК, отмечаются преимущества и недостатки каждого из них и необходимость соблюдения строго определенных условий для получения четких повторяющихся результатов. Так же как и по нуклеотидному составу ДНК, приводятся конкретные данные отечественной и зарубежной литера-) туры, которые могут служить справочным материалом по уровню молекулярного сходства ДНК у ряда бактерий. [c.4]

Очевидно, недостаточно полная информация, которую дает даже комплекс всех доступных исследователю фенотипических свойств, приводит к необходимости подкреплять характеристику по физиологическим и другим свойствам бактерий данными о структуре их ДНК. Поскольку ДНК представляет собой наследственный материал клетки, можно полагать, что подобный подход наиболее надежно способствует приближению к естественной классификации бактерий. Однако изучение нуклеотидного состава ДНК явилось лишь самым начальным этапом в упорядочении систематики бактерий на основе строения генома. Для ее дальнейшего усовершенствования необходимо более глубокое изучение строения ДНК и в частности нуклеотидной последовательности. О сходстве нуклеотидных последовательностей ДНК дает возможность судить метод молекулярной гибридизации ДНК, уже нашедший достаточно широкое применение в современных исследованиях. [c.79]

Приведенные примеры свидетельствуют о том, что применение метода молекулярной гибридизации ДНК в ряде случаев может являться решающим критерием в систематике трудно идентифицируемых другими методами микроорганизмов. [c.91]

США Берг П. Исследования молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот (рекомбинантным ДНК) [c.542]

Метод молекулярной гибридизации ДНК был применен для изучения степени гомологии генома пастерелл [c.84]

Снит (Sneath, 1970), оценивая возможности использования методов молекулярной биологии в систематике, пишет, что поскольку в природе между бактериальными видами происходит обмен частями генома (причем неизвестно, как часто это встречается), данные о молекулярной гибридизации ДНК — ДНК не всегда отражают эволюционное родство микроорганизмов, так как не позволяют установить, происходят ли идентичные части геномов у изучаемых видов от общего отдаленного предка или они сравнительно недавно перенесены от одного вида к другому. [c.86]

Двумерный электрофорез в полиакриламидном геле может быть также использован для локализации участков ДНК, отвечающих 5 - и З -концевым последовательностям и точкам внут-)имолекулярного переплетения ядерной или вирусной РНК 116]. С этой целью продукт гибридизации РНК и ДНК обрабатывают эндонуклеазой S1, специфичной по отношению к одноцепочечным нуклеиновым кислотам, и полученные гибриды комплементарных фрагментов ДНК и РНК разделяют в соответствии с их размерами с помощью гель-электрофореза. Затем в денатурирующих условиях проводят электрофорез во втором направлении, с тем чтобы определить размер образующихся одноцепочечных фрагментов ДНК. Специфические последовательности обнаруживают с помощью блоттинга по Саузерну и последующей молекулярной гибридизации [116]. Одноцепочечные фрагменты ДНК можно легко разделить с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в щелочной среде. Денатурированные образцы подвергают гель-электрофорезу в буфере, содержащем 30 мМ NaOH и 2 мМ ЭДТА [117]. По своему поведению в этих условиях электрофореза такие фрагменты похожи на одноцепочечные фрагменты РНК (разд. 10.5.2). [c.187]

Учитывая, что количественные данные о степени сходства первичных структур ДНК позволяют перейти к таксономии, основанной на родственных связях, большинство современных систематиков (Майр, 1971 Антонов и соавт., 1972 Медников и соавт., 1973 Тахтатджан, 1972 Заварзин, 1974) возлагают большие надежды на метод молекулярной гибридизации ДНК в применении к созданию естественной системы организмов. [c.86]

В этом разделе дается представление о принципах методов молекулярной гибридизации ДНК, нашедпшх в последние годы наибольшее распространение. [c.133]

Молекулярная гибридизация в растворе с последующим от-детением гиэридов на гидрокстапатите (ГАП) (Вгеппег et al., 1969). Гибриды получают в 0,12М фосфатном буфере (pH 7,0) при смешении денатурированной ДНК из одного штамма с денатурированными фрагментами меченой ДНК из другого штамма. Смесь нагревают в течение 10—15 мин. в кипящей водяной бане, инкубируют при 60, 66 или 75° в течение 20—24 час., а затем быстро охлаждают во льду. Полученные таким образом пробы можно хранить в замороженном состоянии до использования. [c.134]

Б — результаты молекулярной гибридизации фрагментов ДНК, перенесенных на диазо-бензилоксиметилцеллюлозу, с Р-меченной плазмидой JW102, содержащей последовательность кДНК й-глобина человека. Гибриды обнаруживала с помощью радиоавтографии (рентгеновскую пленку предварительно засвечивали импульсной вспышкой), а—ж обозначены полосы, которые отвечают фрагментам ДНК, содержащим участки гена -глобина. [c.186]

Рекомбинантные ДНК могут быть широко использованы для выявления возбудителей методом молекулярной гибридизации. Этот метод позволяет быстро и точно диагностировать инфекционные болезни, может использоваться для пренатального диагноза генетических дефектов, выявления животных — носителей возбудителя. Метод основан на использовании зондов — ДНК, меченных радиоактивными соединениями или биочипами, с последующей гибридизацией зондов с образцами ткани животного — носителя возбудителя болезни. Это особенно ценно для выявления скрытых инфекций (хламидиозы, медленные инфекции). Использование молекулярных зондов на основе ДНК позволяет идентифицировать близких по своим свойствам возбудителей. [c.254]

Молекулярная гибридизация нуклеиновых кислот — метод определения степени гомологичности нуклеиновых кислот, основанный на их спосо б-ности к ренативации. [c.553]

С помощью теста молекулярной гибридизации можно также продемонстрировать комплементарность ДНК Е. соН и мРНК незараженных клеток. Однако результаты опыта по гибридизации бактериальной ДНК и РНК гораздо труднее интерпретировать, чем в случае индуцированной фагом РНК и фаговой ДНК, так как в бактериальной ДНК содержится гораздо больше генов, а следовательно, и гораздо большее разнообразие нуклеотидных последовательностей. Поскольку, как мы увидим в гл. XX, скорость, с которой транскрибируются разные гены бактерии, очень различается, количество молекул РНК, комплементарных разным бактериальным генам, сильно варьирует. Между тем в ДНК, добавленной к тибрпдизационной смеси, содержится равное количество всех бактериальных генов. [c.397]

В реакционную смесь добавляли меченные радиоактивными изотопами субстраты РНК-полимеразы и исследовали образовавшуюся РНК в опытах по молекулярной гибридизации. Оказалось, что такая синтетическая РНК образует гибридные двойные спирали при совместном отжиге с РФ-ДНК- Она, однако, не образует таких гибридов с плюс -цепью ДНК, выделенной из зрелых частиц фага 0X174. Из этого следует, что РНК-полимераза в реакционной смеси не только образует цепь РНК, комплементарную добавленной к ферменту ДНК, но даже выбирает в качестве матрицы из двух комплементарных цепей РФ-ДНК именно мипус -цепь — ту самую цепь, которая только и активна в реакции транскрипции in vivo. [c.401]

Все типы РНК (рРНК, тРНК, мРНК) Синтезируются сходным образом. Поэтому для любой имеющейся в организме молекулы РНК можно найти (например, методом молекулярной гибридизации ДНК—РНК) участок ДНК, которому она строго комплементарна. [c.355]

Во второй системе у реассортантных вирусов, полученных после смешанной инфекции, вызванной родительскими вирусами с хорошо различимыми фенотипами, определяли происхождение каждого сегмента РНК с последующим изучением в соответствующей клеточной системе с целью определения сегмента (или сег-.ментов) РНК вирулентного родительского вируса, обусловливающего вирулентность. Методы, используемые для генотипирования реассортантных вирусов, более детально описаны в главе 4, вклЮ чая сравнение родительских и реассортантных вирусов в отношении нескольких параметров — характера миграции РНК в ПААГ [37] белкового спектра, выявляемого в ПААГ [38] олигонуклеотидного строения отдельных сегментов РНК [64] прямой молекулярной гибридизации кРНК с меченными радиоактивными веществами отдельными сегментами вирионной РНК [45] и конкурентной гибридизации, при которой сегменты РНК исследуемых вирусов использовали для конкуренции при связывании меченой вРНК и кРНК [6]. [c.298]

Для идентификации бактерий иногда используют также метод ДНК-зондов (генных зондов), являющийся разновидностью метода молекулярной гибридизации ДНК—ДНК. Реакция гибридизации ведется в этом случае не между двумя препаратами тотальной ДНК, а между фрагментом нуклеотидной последовательности ДНК (зондом), включающим ген (генетический маркер), ответственный за какую-то определенную функцию (например, устойчивость к какому-нибудь антибиотику), и ДНК изучаемой бактерии. Самым распространенным способом создания генных зондов является выделение специфических фрагментов путем молекулярного клонирования. Для этого вначале создают банк генов изучаемой бактерии расщеплением ее ДНК эндонуклеазами рестрикции, а затем отбирают нужный клон из суммы фрагментов ДНК методом электрофореза с последующей проверкой генетических свойств этих фрагментов методом трансформации. Далее выбранный фрагмент ДНК с помощью фермента лигазы вводят в состав подходящей плазмиды (вектора), а эту комбинированную-плазмиду вводят в удобный для работы штамм бактерий (например, Es heri hia соН). Из биомассы бактерии, несущей ДНК-зонд, выделяют плазмидную ДНК и метят ее, например, радиоизотопной меткой. Затем осуществляют гибридизацию ДНК зонда с ДНК бактерии. Образовавшиеся гибридные участки проявляют методом ауторадиографии. По относительной частоте гибридизации генетического маркера с хромосомой той или иной бактерии делают заключение о генетическом родстве этих бактерий с исследуемым штаммом. [c.197]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология