Секвенирующий гель-электрофорез

СЕКВЕНИРУЮЩИЙ ГЕЛЬ-ЭЛЕКТРОФОРЕЗ [c.168]

Секвенирующий гель-электрофорез [c.293]

Был описан интересный способ получения одноцепочечной матрицы ДНК, легший позднее в основу такого высокопроизводительного метода как твердофазное секвенирование (рис. 2.7) [Stahl et al., 1988]. В цитируемой работе фрагмент ДНК, меченный биотином, сорбировался на твердой фазе в виде авидин-агарозы. После этапов денатурации щелочью и последующей отмывки на оставшейся одной цепи ДНК, связанной через биотин-авидиновый комплекс с агарозой, отжигался секвенирующий праймер и шло построение комплементарной цепи ДНК Кленовским фрагментом ДНК-полимеразы в условиях терминации. Затем еще один раунд щелочной денатурации приводил к высвобождению новосинтезированных цепей ДНК, пригодных для их разделения секвенирующим гель-электрофорезом. Справедливости ради следует отметить, что авторы в данной статье упоминают о принципиальной возможности повторения циклов отжига праймера и построения цепи по сорбированной матрице, что [c.56]

В описанном выше полуэкспоненциальном циклическом секвенировании ДНК процессы получения все новых копий полноразмерного продукта и образования терминированных цепей ДНК, предназначенных для их последующего секвенирования, происходят одновременно и оказывают очень сильное влияние друг на друга. Так, если будет превалировать второй процесс, то как таковой амплификации, приводящей к резкому увеличению числа молекул полноразмерного фрагмента, не произойдет, следовательно, недостаточное количество матриц ДНК для их копирования в условиях терминации (секвенирования) не позволит выявить эти продукты в секвенирующем гель-электрофорезе. Превалирующий первый процесс, хотя и приведет к заметной амплификации, все же не позволит увидеть лестницу секвенируемых полос ДНК по той же причине нехватки конечного продукта в виде специфически терминированных фрагментов ДНК. Поэтому идеальным вариантом можно было бы считать некое разобщение этих двух, одновременно протекающих в одной пробирке процессов - построение новых цепей ДНК (амплификация) и специфическое терминирование продуктов удлинения праймера (секвенирование). [c.156]

Стекла довольно маленького размера (обычно 14 см, но с возможным варьированием от 6 см до 20 см) для секвенирующего гель-электрофореза использовались со специальным прибором, рассчитанным на прямое электрофоретическое блоттирование [Веек, Pohl, 1984], Принцип метода заключается в постоянном движении специальной нейлоновой мембраны и ее тесном контакте с нижним срезом геля. Таким образом, фрагмент ДНК, выходя из геля, переносится на данную мембрану и сорбируется в определенном месте. Поскольку используемая длина геля оказывается достаточной для разделения одного фрагмента ДНК, отличающегося на один нуклеотид, от другого, то отпадает надобность в стеклах большого размера, требующих значительно большего времени до выхода образца из геля. После экспозиции данной мембраны с сорбированными на ней фрагментами ДНК на рентгеновскую пленку удается прочитать 500-600 и даже около 1000 нуклеотидов. [c.171]

Сам гелевый матрикс тоже не остался без изменения. Был предложен раствор геля HydroLink, имеющий целый ряд преимуществ перед стандартным полиакриламидным гелем, и мономеры которого к тому же менее токсичны по сравнению с акриламидом [Gelfi et al., 1990]. Этот гель характеризуется более высокой механической прочностью и химической стабильностью, позволяющей применять буферы с высоким pH. По существу, щелочные условия проведения секвенирующего гель-электрофореза, исключающие формирование у одноцепочечных фрагментов ДНК вторичной структуры без использования мочевины, позволили сократить время обращения с таким гелем перед этапом радиоавтографии за счет исключения необходимого ранее этапа ее удаления. Отсутствие мочевины в геле имеет также еще одно небольшое преимущество, заключающееся в более удобном нанесении препаратов ДНК в ячейки геля, чему обычно препятствует диффундирующая в буфер мочевина. Результатом применения такого геля стало большее количество (свыше 600) и более высокое качество читаемых полос ДНК с радиоавтографа геля. [c.173]

Для проведения секвенирующего гель-электрофореза фрагментов ДНК, кроме специально изготовленной камеры, которая может быть весьма простой и способной только поддерживать стекла с залитым между ними гелем, даже не обеспечивая при этом отвод выделяющегося в процессе электрофореза тепла, необходим высоковольтный источник питания. Для эффективного разделения в полиакриламидном секвенирующем геле фрагментов ДНК подаваемое напряжение должно быть в пределах от 30 до 50 В на см длины геля и, учитывая его большой размер, источник питания должен обеспечивать стабилизацию напряжения не менее 2000 В. Для более эффективного разделения фрагментов ДНК и повышения общей производительности метода можно порекомендовать приобретение фабрично изготовленного прибора, в котором предусмотрено и определенное удобство заливки геля и дальнейшего обращения с ним, и равномерное распределение Джоулева тепла во время электрофореза, и комплект запасных спейсеров и гребешков. Выбор подобных аппаратов, включая автоматические секвенаторы ДНК, достаточно велик, но и их стоимость весьма существенна. Однако следует отметить, что для осуществления небольших проектов секвенирования ДНК не обязательно приобретать дорогостоящие автоматические секвенаторы (хотя в последнее время появились относительно недорогие модели, о которых речь пойдет в главе, посвященной автоматическому секвенированию ДНК). [c.181]

Уже упоминавшаяся компрессия фрагментов ДНК при их разделении секвенирующим гель-электрофорезом представляет одну из самых серьезных проблем, которая приводит, подчас, к неверному прочтению правильной последовательности отдельных нуклеотидов. Известно, что такая аномальная подвижность определенных фрагментов ДНК вызвана формированием участков со вторичной структурой на З -кон-це новосинтезированного фрагмента ДНК. Если внимательно рассмотреть процесс образования компрессии, то можно видеть, что обычно в ее формировании принимают участие 3-4 нуклеотида (по одной цепи), представляющие собой, как правило. С- и С-основания (рис. 4.4). Причем до какого-то участка ДНК никаких шпилечных структур не возникает и фрагмент ДНК имеет нормальную подвижность. Но следующий по размеру фрагмент ДНК, показывающий компрессию, отличается от предыдущего только на один терминальный нуклеотид (дидезоксинуклеотид). Проксимальным дезоксинуклеотидом (К - 1) для данного фрагмента является тот же терминальный дидезоксинуклеотид предыдущего фрагмента. Таким образом, добавление только одного очередного нуклеотида приводит к формированию участка вторичной структуры. Дальнейшее увеличение рассматриваемого здесь фрагмента ДНК еще на 1-2 нуклеотида сохраняет за ним сформировавшийся участок вторичной структуры и, как следствие, имеет место компрессия полос ДНК. Однако при присоединении последующих нуклеотидов подобные шпилечные структуры теряют свою прочность, исчезает эффект компрессии и фрагмент ДНК приобретает свою обычную подвижность. [c.183]

Химическая деп>адация, секвенирующий гель-электрофорез [c.238]

Ранее схожий метод мультиплексной геномной прогулки был применен для определения нуклеотидной последовательности неклони-рованного гена пируваткиназы Е. соИ [Ohara et al., 1989]. Суть такой прогулки , весьма напоминающей праймерную (описанную ниже в разделе 8.4), заключается в расщеплении тотальной ДНК несколькими подходящими рестрикционными эндонуклеазами, разделении полученных фрагментов в денатурирующем секвенирующем гель-электрофорезе, их переносе на нейлоновый фильтр и многочисленных гибридизациях с мечеными олигонуклеотидами (рис. 8.3). [c.239]

Существуют различные схемы проведения терминирующих реакций и последующего разделения продуктов в секвенирующем гель-электрофорезе. Так, довольно обычным, в том числе и для неавтоматического секвенирова- [c.42]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология