Чтение нуклеотидной последовательности с радиоавтографа геля

Этап радиоавтографии является одной из заключительных стадий всего процесса секвенирования ДНК и последним экспериментальным этапом, повторить который не всегда возможно простым повторным экспонированием этого же геля в отличие от следующих этапов в виде чтения нуклеотидной последовательности с радиоавтографа и компьютерного анализа, проводить которые можно неограниченное число раз. В связи с этим, несмотря на кажущуюся простоту данного этапа, его проведение требует должного внимания и определенной подготовки гелей, уже описанной выше. [c.192]

Однако при осуществлении крупных проектов по секвенированию этап чтения нуклеотидной последовательности с радиоавтографа геля становится достаточно узким местом , что вызвало разработку специальных приборов, осуществляющих полуавтоматическое и автоматическое считывание последовательности нуклеотидов и ее занесение в компьютер. Рассмотрению этих систем и будет посвящен следующий раздел данной главы. [c.204]

Характер расщепления фрагментов ДНК в методе секвенирования путем химической деградации таков, что для чтения последовательности с радиоавтографа геля наиболее оптимальным вариантом является такой, когда при нанесении на гель одна дорожка (обычно первая) соответствует гуанину, вторая - пуринам, третья - пиримидинам и четвертая - цитозину (рис. 6.1). Таким образом, две средние дорожки содержат большее (кроме потенциально возможных частных случаев) число полос, чем крайние дорожки, поскольку в них видны фрагменты ДНК, ограниченные нуклеотидам и О, А и С, Т соответственно. Таким образом, эти две средние дорожки (О + А и С + Т) вместе содержат все полосы частичного расщепления меченой по одному из концов молекулы ДНК, Правильное прочтение полос, видимых на радиоавтографе геля, заключается, во-первых, в определении вертикальной позиции каждой конкретной полосы, соответствующей тому или иному нуклеотиду, относительно полос в соседних дорожках, относящихся к одному и тому же образцу ДНК, и, во-вторых, в выявлении типа нуклеотидов, к которому принадлежит данная полоса. Так, например, если полоса имеется только во второй дорожке - то это аденин, поскольку для другого пуринового основания - гуанина будет характерно наличие двух полос в первой О-дорожке и совпадающей с ней полосой во второй О + А-до-рожке. Аналогично проводится и чтение пиримидиновых оснований, где полоса только в третьей дорожке указывает, что это тимин, а если эта же полоса имеется и в четвертой дорожке, то тогда это цитозин. Что касается более редко используемых реакций, приводящих к выявлению полос ДНК по типу А > С, А > О, 6 > А, С > Т, то в таких случаях требуется более сложное сопоставление наличия или отсутствия полос в соседних треках. Анализируя таким образом полосы одну за другой и поднимаясь вверх по радиоавтографу, необходимо достигнуть места, где полосы в соседних дорожках расположены так близко друг к другу, что уже невозможно различить их вертикальную последовательность. После этого чтение нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК с данного радиоавтографа можно считать законченным. Если же этот образец был нанесен на гель дважды, то для ранее нанесенного препарата на радиоавтографе будут видны фрагменты ДНК большего размера. В таком случае надо найти перекрывающиеся участки (что гораздо легче сделать, если в секвенируемой последовательности ДНК содержатся какие-нибудь характерные участки как, например, ААААОСАААА или им подобные, хорошо заметные глазом) и продолжить чтение данного образца ДНК, пока позволяет достигну- [c.199]

Задачи, стоящие перед исследователями, требовали определения нуклеотидных последовательностей довольно протяженных фрагментов ДНК, которые не могли быть прочитаны за одно электрофоретическое разделение продуктов секвенирующих реакций. В первые годы секвенирования ДНК предел чтения с радиоавтографа геля редко превышал 250-300 нуклеотидов для одной матрицы. Да и фермент ДНК-полимераза I, ее Кленовский фрагмент, имея низкую процессивность, не мог эффективно строить комплементарную цепь ДНК большой протяженности. Метод химической деградации вкупе со стандартным гель-электрофорезом того времени также не позволял читать более 250-300 нуклеотидов. В связи с этим решение проблемы секвенирования больших вставок, нуклеотидные последовательности которых не могли быть определены в одном эксперименте, заключалось в выработке специальных подходов. С течением времени, благодаря различным новшествам, разрешающая способность методов секвенирования заметно возросла и за счет этого увеличился оптимальный размер вставок до 500 и 1000 пн, позволяющий определить их последовательность в процессе одного электрофоретического разделения. Резко возросли и задачи, предполагающие уже определение нуклеотидных последовательностей еще более крупных фрагментов ДНК или даже целых геномов. Все это привело к разработке большого числа различных стратегий секвенирования протяженных фрагментов ДНК, к рассмотрению которых мы и приступаем. [c.234]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология