Максама Гилберта метод секвенирования

Рис. 11.14. Схема эксперимента по секвенированию фрагмента ДНК по методу Максама — Гилберта. А — схема специфической химической модификации нуклеотидов в ДНК Б — результат электрофореза в денатурирующем полиакриламидном геле и его интерпретация. Цифры в скобках — длина фрагментов, выраженная в

Метод расщепления, используемый при секвенировании по Максаму — Гилберту, основан на реакции расщепления полидезоксирибонуклеотидной цепи по остаткам, лишенным гетероцикла, т.е. по апуриновым или апиримидивовым фрагментам. Это расщепление проходит в присутствии оснований по схеме [c.279]

В настоящее время существует множество вариантов как метода Максама — Гилберта, так и метода Сэнгера. Главное, эти методы удалось полностью автоматизировать. Так, например, при секвенировании ДНК по Сэнгеру на 5 -конец праймера вводят флуоресцентные метки, причем для каждого из четырех анализируемых нуклеотидов используются флуоресцирующие агенты с различными спектральными характеристиками. После электрофоретического разделения гель сканируется при четырех различных длинах волн и полученная информация сразу обрабатывается на ЭВМ. При этом все биохимические операции также проводятся роботом. [c.19]

СГРАТЕгаИ СЕКВЕНИРОВАНИЯ ПРОТЯЖЕННЫХ ФРАГМЕНТОВ ДНК МЕТОДОМ ХИМИЧЕСКОЙ ДЕГРАДАЦИИ ПО МАКСАМУ-ГИЛБЕРТУ [c.234]

При помощи метода Максама — Гилберта можно секвениро-вать как однонитевую, так и двунитевую ДНК, так как меченный с одного конца двунитевой фрагмент ДНК несет метку только с 5 -конца одной нити ДНК. Стратегия секвенирования длинных (> 1000 п. н.) фрагментов ДНК состоит в следующем [c.285]

ДНК-полимеразной реакции (рассуатриваемой в гл. II при обсуждении репликации ДНК). Принцип метода показан иа рис. 7. Как и при секвенировании ДНК по Максаму — Гилберту, здесь добиваются, чтобы обрыв цепи (при попадании на ее З -конец комплементарного терминаторного нуклеотидного остатка) происходил равновероятно по всем положениям данного остатка (рис. 7 — остаток Т). Это достигается экспериментальным выбором правиль ного соотношения дезоксинуклеозидтрифосфатов и терминаторного [c.18]

СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК МЕТОДОМ ХИМИЧЕСКОЙ ДЕГРАДАЦИИ ПО МАКСАМУ-ГИЛБЕРТУ [c.19]

Реакция проходит как по остаткам цитозина, так и по остаткам тимина. Однако в щелочной среде (0,1М КОН в гидразингидрате) реакция по дезокситимидиновым фрагментам подавляется и модификация проходит только по остаткам дезокси-цитидина. Это позволяет получить картину распределения остатков обоих пиримидиновых нуклеотидов и отдельно — дезоксицитидиновых звеньев. Этой информации достаточно, чтобы определить положение раздельно по каждому из пиримидиновых нуклеотидов. На рис. 78 приведены радиоавтограф геля, полученного методом Максама — Гилберта, и прочитываемая по этому гелю последовательность секвенированного полинуклеотида. [c.280]

Практически параллельно с методом Максама — Гилберта был развит другой метод секвенирования ДНК, получивший по имени создавшего его автора название метод Сэнгера. Этот метод считается наиболее перспективным для исследования первичной структуры больших молекул нуклеиновых кислот, вплоть до ДНК хромосом человека. В бго основе лежит анализ структуры не самой нуклеиновой кислоты, а продукта, получаемого в ходе ее репликации с помощью ДНК- юлимеразы. Аналогично, используя обратную транскрипцию, с помощью РНК-зависимой ДНК-полимеразы можно анализировать структуру молекул РНК. [c.281]

Определение первичной структуры ДНК долгие годы оставалось неразрешимой задачей. В 70-х гг XX в. с открытием ферментов рестриктаз, разрезающих молекулы ДНК в строго определенных точках, А. Максамом и В. Гилбертом был разработан метод секвенирования, позволяющий определять последовательности до 1000 нуютеотидов. В 1985 г удалось создать прибор для автоматического анализа нукнеиновых кислот. В последнее десятилетие в этой области наметился существенный прогресс, в результате чего определена последовательность не только отдельных генов, но и целых хромосом у разных видов живых организмов, в том числе и человека. Все данные по структуре генов, публикующиеся в мировой научной литературе, вводятся в память компьютера, формируя банк данных. [c.178]

Дополнение 27-1. Секвенирование короткого фрагмента ДНК при помопщ химического метода Максама-Гилберта [c.887]

Как уже отмечалось выше, для определения нуклеотидных последовательностей ДНК методом Максама-Гилберта необходимо наличие фрагментов ДНК, несущих на одном из концов какую-либо метку. Отдельные частные случаи секвенирования ДНК методом химической деградации (геномное и мультиплексное секвенирование, рассматриваемые в других главах) могут проводиться даже с немечеными препаратами ДНК. Концевое мечение секвенируемых фрагментов ДНК можно осуществить при помощи различных ферментов. Так, с помощью поли-нуклеотидкиназы фага Т4 и молекулы АТФ, несущей радиоактивный фосфор в у-положении, проводится мечение 5 -концов одно- или двуцепочечного фрагмента ДНК. Эффективность мечения тупых или 5 -углубленных концов двуцепочечного фрагмента ДНК значительно ниже, -чем 5 -выступающих. Для более эффективного мечения необходим предварительный этап дефосфорилирования фрагмента ДНК с помощью щелочной фосфатазы. Особая забота должна быть проявлена при последующем удалении щелочной фосфатазы, что достигается обычно фенольной депротеинизацией, так как остаточная фосфатазная активность может резко снизить эффективность этапа мечения. Мечение путем обменной реакции позволяет обойтись без этапа дефосфорилирования и требует присутствия в реакционной смеси в качестве акцептора молекул АДФ, однако эффективность мечения при этом будет значительно ниже. [c.22]

С помощью этого метода за короткий срок удалось установить полную нуклеотидную последовательность ДНК SV 40, рекомбинантной плазмиды pBR322 и многих других последовательностей ДНК. Однако секвенирование методом Максама-Гилберта имеет ряд недостатков, связанных с длительностью и значительной трудоемкостью процедур. В настоящее время на основе секвенирования с помощью химической деградации разработаны усовершенствованные и быстрые методы определения нуклеотидной последовательности, в том числе твердофазное секвенирование и секвенирование с использованием обращенно-фазовой хроматографии. [c.30]

Методы секвенирования различаются в первую очередь по способу радиоактивного мечения, и кроме того по способу вьщеления исходного набора фрагментов. Представленная на рис. 9.8 схема основана на методе, разработанном Максамом и Гилбертом. Рестрикционный фрагмент метят радиоактивным изотопом Р в 5 -конце с использованием [у - Р] АТР и фермента, называемого полинуклеотидкиназа. Затем комплементарные цепи разделяют и в них независимо определяют последовательность нуклеотидов. На рис. 9.8 изображена одна цепь звездочка обозначает радиоактивную метку Р на 5 -конце. Четыре отдельных образца этого фрагмента подвергают действию различных реагентов, в результате чего образуется четыре исходных набора фрагментов различной величины. Фрагменты каждого из этих наборов на 5 -конце содержат радиоактивную метку, а на другом конце - определенный нуклеотид (см. рис. 9.8). (При этом образуются также наборы фрагментов с одинаковыми З -кон-цами, однако, эти фрагменты не попадают в поле зрения исследователя, поскольку не содержат радиоактивной метки). Затем четыре исходных набора фрагментов подвергают электрофорезу в полиакриламидном геле бок о бок . Положение каждого фрагмента в геле можно зафиксировать на обычной рентгеновской пленке. При этом обнаруживается набор полос, каждая из которых соответствует фрагменту определенного размера. Изображенная на рис. 9.8 последовательность фрагментов позволяет прямо с рентгеновской пленки считывать последовательность нуклеотидов, начиная с 5 -конца (т. е. снизу). На рис. 9.9 представлены реальные результаты радиоавтографии геля после электрофореза фрагментов. Как указывается в подписи к рисунку, в действительности нет необходимости в том, чтобы разрезание фрагментов исходного набора производилось по одному и тому же нуклеотиду. [c.273]

МО иметь большое количество идентичных молекул ДНК. Наработку интересующей последовательности можно осушествить клонированием соответствующего фрагмента. Проиллюстрированный на рис. 36.6 метод секвенирования по Максаму-Гилберту основан на химическом расщеплении ДНК по определенному основанию. Другой ферментативный метод—метод Сэнгера—базируется на применении аналогов нуклеотидов, прерывающих синтез комплементарной цепи ДНК по одноцепочечной матрице в месте встраивания в цепь соответствующего аналога. [c.44]

Простота, с которой можно получить четкие надежные данные, не прибегая к клонированию в бактериях, определяется 1) способностью ПЦР-затравок амплифицировать только интересующие последовательности (специфичность праймера) и 2) способом получения образца, приемлемого для секвенирования. Для прямого секвенирования продуктов ПЦР вполне пригоден химический метод (Максама — Гилберта). Мы рассмотрим здесь только наиболее распространенный метод Сэнгера, использующий нуклеотиды-терминаторы полимеразной реакции. Специфичность ПЦР-затравок в принципе определяет гомогенность амплифицируемых последовательностей. В идеале, в результате реакции экспоненциально наращивается только интересующая последовательность. Однако в реальных условиях многие праймеры амплифицируют также различные посторонние последовательности. Повышая температуру отжига в полимеразной реакции, это осложнение удается преодолеть [12]. К тому же для устранения затруднений, связанных со свойствами конкретной амплифицируемой последовательности, можно применить предварительную очистку интересующей последовательности электрофорезом в геле или использовать денатурирующий градиентный гель [15]. [c.185]

Секвенирование олигонуклеотидов по методу Максама — Гилберта. [c.284]

В общих чертах стратегия Сенгера сохранила свое значение и до наших дней, однако за истекшие десятилетия были разработаны два новых подхода, которые произвели революцию в определении первичной структуры полипептидов (белков). Первый подход основан на разработанной Эдманом в 1967 г. автоматической процедуре последовательного отщепления и идентификации N-кoнцeвыx аминокислотных остатков в виде их фенилтиогидантоиновых производных. Второй подход связан с методом, разработанным Сенгером и, независимо, Максамом и Гилбертом, позволяющим проводить быстрое и однозначное секвенирование гена, кодирующего рассматриваемый белок. Оптимальная стратегия состоит в одновременном использовании обоих подходов. Автоматическая деградация по Эдману, намного более быстрая по сравнению с первоначальным ручным методом Сенгера, тем не менее сильно уступает по скорости методам секвенирования ДНК и сопряжена с рядом трудностей. С другой стороны, секвенирование ДНК не всегда дает однозначную первичную структуру исследуемого белка. Главным [c.38]

Все рассмотренные выше стратегии секвенирования протяженных фрагментов ДНК методом Максама-Гилберта нельзя отнести к стратегиям случайного подхода, так как они основывались, как правило, на знании рестриктазной карты клонированного фрагмента ДНК и были рассчитаны на получение конкретных субфрагментов ДНК или субклонов. В то же время возможность случайного раздробления крупного фрагмента ДНК физическими методами и получение на их основе субклонов для их последующего секвенирования методом химической деградации принципиально возможны, хотя и не производительны. При этом, однако, необходимо отметить, что совершенствование векторных систем и их использование для определения нуклеотидных последовательностей протяженных фрагментов ДНК химической деградацией по Максаму-Гилберту не смогло значительно повысить производительность этого метода, разве что, кроме, метода мультиплексного секвенирования. [c.237]

Условия проведения химических реакций в методе секвенирования ДНК по Максаму-Гилберту [c.36]

В ферментативном методе секвенирования ДНК по Сэнгеру каждая дорожка соответствует только одному конкретному типу оснований (рис. 6.2) и поэтому для правильного прочтения радиоавтографа секвенирующего геля необходимо следить, чтобы какая-либо полоса содержалась только в одной дорожке, поскольку в противном случае точное установление данного нуклеотида будет затруднено или скорее просто невозможно. В связи с тем, что в отличие от картины полос секвенируемой ДНК по Максаму Гилберту в методе Сэнгера нет необходимости сопоставления наличия полос пуриновых или пиримидиновых оснований в одной или двух дорожках, то можно считать, что чтение радиоавтографа секвенирующего геля при этом будет несколько проще. [c.200]

Секвенирование больших фрагментов ДНК методом химической деградации по Максаму-Гилберту было возможно путем построения подробной рестриктазной карты клонированного фрагмента ДНК, разработки на ее основе стратегии секвенирования, заключающейся в выборе тех или иных рестриктазных фрагментов исследуемого клона, полностью перекрывающих всю длину вставки (рис. 8.1). Далее следовал этап препаративного расщепления ДНК соответствуюпщми рестрикционными эндонуклеазами, препаративный гель-электрофорез, концевое мечение элюированных фрагментов и проведение реакций химической модификации и гидролиза. Следует отметить, что данный подход к секвенированию крупных вставок методом Максама-Гилберта вполне может быть применен и в настоящее время, однако разработ- [c.234]

Чтобы не перегружать рисунки и не устраивать непроходимую чащу и одновременно не делать болшое их количество, мы решили стандартное секвенирование ДНК уместить всего в 3 рисунках, условно разделив весь процесс на две стадии. К первой оказалось отнесено все то, что предшествует электрофоретическому разделению продуктов секвенирующих реакций. Вторая стадия состоит из самого электрофореза и некоторых последующих процедур. Таким образом, нарисованными оказались только все вариации двух классических методов секвенирования ДНК по Максаму-Гилберту и Сэнгеру. [c.417]

Смотреть страницы где упоминается термин Максама Гилберта метод секвенирования: [c.239] [c.298] [c.185] [c.287] [c.134] [c.19] [c.19] [c.20] [c.33] [c.39] [c.86] [c.168] [c.198] [c.200] [c.202] [c.203] [c.237] [c.249] [c.284] [c.330] [c.339]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология