Стратегии секвенирования протяженных фрагментов ДНК

Что касается ферментативного секвенирования ДНК по Сэнгеру, то этот метод изменился за эти годы весьма сильно и разработанные стратегии секвенирования протяженных фрагментов ДНК оказали заметное влияние на его общую производительность. Большинство существующих стратегий секвенирования протяженных фрагментов ДНК ферментативным методом основаны на получении серии субклонов. Различают два главных подхода к их получению, один из которых считается случайным, а другой направленным. В основе стратегий случайного подхода лежит произвольная фрагментация ранее клонированного фрагмента ДНК и дальнейшее получение субклонов с небольшими вставками в другом векторе (а не в исходном), причем их размер, как правило, позволяет осуществить определение нуклеотидной последовательности всего субклонированного фрагмента за один эксперимент без дополнительного этапа субклонирования. Стратегии направленного подхода предполагают создание серии субклонов обычно в составе исходного вектора, различающихся размером делетированных участков вставки между сайтом какой-либо подходящей полилинкерной рестрикционной эндонуклеазы, предшествующим сайту клонирования (со стороны отжига секвенирующего праймера), и прогрессивно удаляющимися местами вставки. И тот и другой подходы имеют как свои преимущества, так и недостатки, к рассмотрению которых мы и перейдем. [c.240]

СТРАТЕГИИ СЕКВЕНИРОВАНИЯ ПРОТЯЖЕННЫХ ФРАГМЕНТОВ ДНК [c.234]

Все рассмотренные выше стратегии секвенирования протяженных фрагментов ДНК методом Максама-Гилберта нельзя отнести к стратегиям случайного подхода, так как они основывались, как правило, на знании рестриктазной карты клонированного фрагмента ДНК и были рассчитаны на получение конкретных субфрагментов ДНК или субклонов. В то же время возможность случайного раздробления крупного фрагмента ДНК физическими методами и получение на их основе субклонов для их последующего секвенирования методом химической деградации принципиально возможны, хотя и не производительны. При этом, однако, необходимо отметить, что совершенствование векторных систем и их использование для определения нуклеотидных последовательностей протяженных фрагментов ДНК химической деградацией по Максаму-Гилберту не смогло значительно повысить производительность этого метода, разве что, кроме, метода мультиплексного секвенирования. [c.237]

Завершая рассмотрение стратегий секвенирования протяженных фрагментов ДНК направленным подходом, следует отметить, что объединение их в этом разделе диктовалось некоторыми присущими им общими чертами. Большинство этих стратегий предполагает последующее получение субклонов как в новом, так и в исходных векторах и, во-вторых, при создании таких субклонов или уже матриц для секвенирования ДНК принимают участие одинаковые или во многом сходные по своему действию ферменты. [c.281]

Задачи, стоящие перед исследователями, требовали определения нуклеотидных последовательностей довольно протяженных фрагментов ДНК, которые не могли быть прочитаны за одно электрофоретическое разделение продуктов секвенирующих реакций. В первые годы секвенирования ДНК предел чтения с радиоавтографа геля редко превышал 250-300 нуклеотидов для одной матрицы. Да и фермент ДНК-полимераза I, ее Кленовский фрагмент, имея низкую процессивность, не мог эффективно строить комплементарную цепь ДНК большой протяженности. Метод химической деградации вкупе со стандартным гель-электрофорезом того времени также не позволял читать более 250-300 нуклеотидов. В связи с этим решение проблемы секвенирования больших вставок, нуклеотидные последовательности которых не могли быть определены в одном эксперименте, заключалось в выработке специальных подходов. С течением времени, благодаря различным новшествам, разрешающая способность методов секвенирования заметно возросла и за счет этого увеличился оптимальный размер вставок до 500 и 1000 пн, позволяющий определить их последовательность в процессе одного электрофоретического разделения. Резко возросли и задачи, предполагающие уже определение нуклеотидных последовательностей еще более крупных фрагментов ДНК или даже целых геномов. Все это привело к разработке большого числа различных стратегий секвенирования протяженных фрагментов ДНК, к рассмотрению которых мы и приступаем. [c.234]

Рис. 8.1. Стратегия секвенирования протяженного фрагмента ДНК методом химической деградации, основанная на знании детальной рестриктазной карты

Описанные выше варианты направленной стратегии секвенирования протяженных фрагментов ДНК основаны на особенностях действия используемых ферментов. Так, ДНКаза I в присутствии ионов марганца производит разрыв обеих цепей ДНК с образованием или тупых концов, или с небольшим количеством выступающих нуклеотидов, легко поддающихся репарации. Этот же фермент в присутствии интеркалирующего красителя бромистого этидия делает так называемые ники в виде одиночных разрывов одной цепи ДНК. Специфичная к однонитевой ДНК S1 нуклеаза применяется для разрыва второй цепи ДНК в месте образовавшегося ника или целого участка одноцепочечной ДНК, сформировавшегося после расширения ника с помощью экзонуклеазы III. Для этой же цели используют и другую нуклеазу Ва131, обладающую относительно слабой эндонуклеазной активностью, специфичной для однонитевой ДНК. (Более сильная экзонуклеазная активность этого фермента позволяет деградировать двуцепочечные участки ДНК). Еще один фермент - экзонуклеаза III, используемый вместе с другими ферментами (нуклеазами) в некоторых из упомянутых выше способах для удаления одной цепи ДНК, начиная с ника увеличивает в направлении 3 5 участок одноцепочечной ДНК. [c.256]

Почти все рассмотренные выше стратегии секвенирования протяженных фрагментов ДНК в составе фаговых, плазмидных или фагмидных векторов направленного подхода требуют в той или иной степени предварительного этапа рестриктазного картирования вставки с целью выявления отсутствия в ней сайтов узнавания полилинкерных гексану- [c.273]

Стратегии секвенирования протяженных фрагментов ДНК в составе фагмидного вектора путем получения субклонов II порядка с использованием гексануклеотидных рестрикционных эндонуклеаз, как уже отмечалось выше, достаточно просты по исполнению, но учитывая весьма редкую встречаемость их сайтов (теоретически один сайт на 4096 пн), часто бывает невозможно получить необходимый набор делеционных вариантов, позволяющих при секвенировании определить полную нуклеотидную последовательность всей вставки без промежутков. Решением проблемы могло бы быть использование для этой цели частощепящих рестрикционных эндонуклеаз с тетрануклеотидными сайтами узнавания (теоретическая частота встречаемости которых составляет 1 сайт на 256 пн) в условиях недорестрикции. Однако, использование подобных ферментов для этой цели практически невозможно из-за присутствия множества сайтов этих рестрикционных эндонуклеаз в самой последовательности обычных фаговых, плазмидных или фагмидных векторов, что неминуемо приведет к их разрушению. [c.275]

Рис. 8.19. Тетра/окта стратегия секвенирования протяженных фрагментов ДНК в специально сконструированном векторе р8ецио1аТ12 Пояснения см. текст

Рис. 8.20. Упрощенный способ тетра/окта стратегии секвенирования протяженных фрагментов ДНК в спещшльно сконструированном векторе pSequoiaT12

СТРАТЕГИИ СЕКВЕНИРОВАНИЯ ПРОТЯЖЕННЫХ ФРАГМЕНТОВ ДНК ФЕРМЕНТАТИВНЫМ МЕТОДОМ ПО СЭНГЕРУ ПРАЙМЕРНОЙ ПРОГУЛКОЙ [c.281]

Рис. 8.21. Стратегия секвенирования протяженных фрагментов ДНК праймерной

СТРАТЕГИИ СЕКВЕНИРОВАНИЯ ПРОТЯЖЕННЫХ ФРАГМЕНТОВ ДНК ПУТЕМ ПОЛУЧЕНИЯ ДЕЛЕЦИОННЫХ СУБКЛОНОВ IN VIVO [c.295]

Рассматриваемые в гл. 8 стратегии секвенирования протяженных фрагментов ДНК ориентированы, в основном, на определение последовательности нуклеотидов в клонированных вставках длиною от 2 тпн до 45 тпн, что соответствует клонам в обычных плазмидных или космидных векторах. Однако простое переложение этих стратегий для секвенирования полных геномов невозможно, поскольку здесь должен действовать комплексный подход. Более того, учитывая большой объем предстоящей работы при секвенировании целых геномов организмов, должен соблюдаться некий баланс между производительностью выбранного метода, включая избыточность, получаемой с его помощью информации и стоимостью всего проекта. Это вместе с большими размерами геномов как бактерий, так и тем более высших организмов диктует свои особенности. Для последних считается, что усилия, прилагаемые на этапе картирования генома, должны соотноситься с тем количеством нуклеотидов, которые необходимо определить [Roa h et al., 1995]. [c.373]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология