Обнаружение нужного клона

СКРИНИНГ КЛОНИРОВАННЫХ ПОПУЛЯЦИЙ РЕКОМБИНАНТНЫХ МОЛЕКУЛ а. Обнаружение нужного клона [c.292]

Гетерологичные зонды. Гетерологичные олигонуклеотидные зонды получают на основании предположения о наличии гомологии в последовательностях у генов организмов разных биологических видов, которые выполняют аналогичные функции. При гибридизации гетерологичных зондов с ДНК исследуемой клонотеки используют более низкие температуры их отжига для того, чтобы даже при наличии нескольких неправильно спаренных оснований в гибриде он оказался достаточно стабильным для обнаружения. Понижение температуры отжига зонда значительно ниже его температуры плавления будет почти неизбежно сопровождаться получением ложноположительных результатов, т.е. гибридизацией зондов с неродственными последовательностями, которые обладают определенной гомологией с искомой. Во многих случаях этот результат не опасен, поскольку после такого предварительного отбора, круг поиска нужной последовательности существенно сужается. Проведение повторной гибридизации в других условиях среди предварительно отобранных клонов может привести к положительному результату. Ситуация становится угрожающей в том случае, если число ложноположительных клонов, выявленных на первом этапе отбора, становится слишком большим. В этом случае цена повторного скрининга может оказаться слишком высокой. [c.164]

Носле разделения рекомбинантных молекул и получения отдельных клонов встает трудно разре-щимая задача—обнаружение нужного клона или клонов. Идентификация клона основывается на том, что вставка в рекомбинантной ДНК детерминирует какое-то уникальное свойство содержащей ее клетки. Это свойство может определяться структурой самой вставки (т.е. нуклеотидной последовательностью) либо быть связанным с ее функцией (т.е. продуктом экспрессии клонированного гена). На нем основывается скрининг популяции клонов с целью идентификации одного нужного клона. Методы скрининга должны быть очень чувствительными, поскольку иногда приходится идентифицировать один клон из сотен тысяч или даже миллионов клонов. [c.292]

Возникновение ложноположительных клонов особенно вероятно в первых раундах отбора белков, эволюционирующих in vitro, когда их активность еще слабо выражена, и для ее обнаружения приходится использовать высокочувствительные гены-репортеры. Часто клетки, выжившие во время такого отбора, не содержат белков, взаимодействующих друг с другом, а являются мутантами, которые обладают искомым фенотипом. Помимо этого, найдется множество других причин, по которым могут вырасти фоновые колонии клеток дрожжей. Подробное описание подходов и конкретных методов, с помощью которых можно снизить влияние ложноположительных клонов на общий исход эксперимента, можно найти в специальных руководствах [132]. Здесь же отметим, что для успешного решения задач по отбору белков в ходе направленной эволюции, необходимо на основании данных литературы выбрать формат оптимальной системы Y2H, в котором соблюден баланс между чувствительностью системы и ее устойчивостью к посторонним шумам. Выводы о взаимодействии белков друг с другом можно делать лишь по степени воспроизводимости результатов с несколькими генами-репортерами. Положительные клоны, полученные при первичном скрининге, должны исследоваться в новом раунде отбора. При этом во вторичном скрининге часто используют систему la Z с геном (3-га-лактозидазы в качестве репортера. Само собой разумеется, что на всех этапах проведения отбора необходимо ставить контрольные пробы, так как весь опыт экспериментальной работы показывает, что лучше поставить десять лишних контролей, чем не поставить одного нужного. Ведь в случае ошибки потери времени будут несопоставимы со временем, затраченным на постановку контрольных экспериментов. [c.364]

Большой интерес для генетической инженерии представляет достижение правильной экспрессии клонированной генетической информации в клетках-реципиентах. Экспрессию легко выявить, если клонируемый ген при правильной транскрипции и трансляции обеспечивает функциональную комплементацию мутаций генома клетки. В этом случае нужный гибрид может быть обнаружен простым отбором трансформированных клонов на селективной среде. Например, в одной из первых работ такого типа, выполненной в 1976 г в лаборатории Р. Дэвиса, выяснилось, что гибридная ДНК, полученная при встройке определенных фрагментов хромосомной ДНК дрожжей-сахаромицетов в ДНК векторного фага Я, комплементирует мутацию Е. соН hisB. Клоны, содержащие такие гибриды, отбирали по способности клеток расти на питательной среде без гистидина. В дальнейшем данный подход неоднократно использовался при попытке клонировать чужеродные гены. [c.35]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология