Гибридизация ДНК зонды

Зонды для скрининга геномной библиотеки можно получить по крайней мере двумя способами. Во-первых, можно использовать клонированную ДНК близкородственного организма (гетерологичный зонд). В этом случае условия гибридизации нужно подбирать таким образом, чтобы она могла происходить при существенном расхождении между нуклеотидными последовательностями зонда и искомой ДНК это позволяет решить проблемы, связанные с заведомым различием между ДНК - источником зонда и исследуемой ДНК. Во-вторых, зонд можно получить методом химического синтеза, основываясь на известной аминокислотной последовательности белкового продукта искомого гена. [c.67]

Рис. 4.13. Скрининг библиотеки геномной ДНК с применением меченого зонда. Клетки после трансформации высевают на твердую питательную среду, обеспечивающую рост только трансформированных клеток. 1. Переносят клетки из каждой выросшей колонии на твердую подложку (например, нитроцеллюлозный или найлоновый фильр) так, чтобы их расположение соответствовало таковому на чащке. 2. Клетки лизируют, высвободившуюся ДНК подвергают денатурации и депротеинизации и фиксируют на фильтре. 3. На фильтр наносят меченый ДНК-зонд и проводят гибридизацию. Смывают с фильтра негибридизовавшийся зонд и проводят радиоавтографию с тем чтобы определить, какие клетки содержат меченый ДНК-зонд. 4. Идентифицируют на чашке колонии, содержащие искомую ДНК (положительный гибридизационный сигнал), отбирают из них материал и культивируют.

Рис. 4.59, Олигонуклеотидный зонд (олигонуклеотид из 19 остатков) для гена нормального -глобина отличается от зонда для гена с мутацией, приводящей к -талассемии только заменой G -> А в интроне IVS-2. В соответствующих условиях гибридизации зонд для мутантного гена будет узнавать только мутантный ген, но не нормальный. Аналогичным образом нормальный зонд не будет гибридизоваться с мутантным геном.

С разработкой быстрых и недорогих методов химического синтеза фрагментов ДНК методология молекулярно-биологических исследований ДНК существенно изменилась. Химически синтезированные олигонуклеотиды можно использовать для конструирования целых генов или их фрагментов, для амплификации специфических фрагментов ДНК, для направленных мутаций изолированных ДНК, а также в качестве зондов при гибридизации и в качестве линкеров, облегчающих клонирование. [c.47]

Очень важной областью применения радиоавтографии является обнаружение радиоактивного ДНК-зонда после его гибридизации с препаратом ДНК, подвергнутым электрофоретическому разделению. К сожалению, провести гибридизацию в самом геле невозможно, поскольку зонд не может в него проникнуть. Поэтому ДНК после электрофореза переносят на нитроцеллюлозный или найлоновый фильтр по методу Саузерна (Саузерн-блоттинг) или с помощью элюции. Расположение молекул ДНК на фильтре в точности соответствует таковому в геле. Перенесенную на фильтр ДНК подвергают [c.65]

Для отбора клеток, содержащих рекомбинантную ДНК, используют специальные приемы. Чтобы уменьшить количество кольцевых плазмидных молекул, образующихся ири сшивании фрагментов ДНК-лигазой Т4, рестрицированную плазмидную ДНК обрабатывают щелочной фосфатазой, удаляющей 5 -концевые фосфатные группы. Для отбора трансформированных клеток, содержащих гибридные плазмиды, проводят 1) тестирование на резистентность к определенным антибиотикам или колориметрическую реакцию 2) иммунологические тесты или выявление специфического белка - продукта клонированного гена 3) гибридизацию с зондом, комплементарным како-му-либо участку искомого гена. [c.78]

Б. Гибридизация зондов с ПЦР-амплифицированной ДНК [c.197]

Степень гибридизации зонда определяют, измеряя радиоактивность двухцепочечных молекул. [c.231]

Если оценивать вероятность Р гибридизации зонда длины W в геномной библиотеке длины п, полагая, что зонд гибридизуется при наличии не менее Ь совпадений, то можно воспользоваться формулой [c.74]

Гетерологичные зонды. Гетерологичные олигонуклеотидные зонды получают на основании предположения о наличии гомологии в последовательностях у генов организмов разных биологических видов, которые выполняют аналогичные функции. При гибридизации гетерологичных зондов с ДНК исследуемой клонотеки используют более низкие температуры их отжига для того, чтобы даже при наличии нескольких неправильно спаренных оснований в гибриде он оказался достаточно стабильным для обнаружения. Понижение температуры отжига зонда значительно ниже его температуры плавления будет почти неизбежно сопровождаться получением ложноположительных результатов, т.е. гибридизацией зондов с неродственными последовательностями, которые обладают определенной гомологией с искомой. Во многих случаях этот результат не опасен, поскольку после такого предварительного отбора, круг поиска нужной последовательности существенно сужается. Проведение повторной гибридизации в других условиях среди предварительно отобранных клонов может привести к положительному результату. Ситуация становится угрожающей в том случае, если число ложноположительных клонов, выявленных на первом этапе отбора, становится слишком большим. В этом случае цена повторного скрининга может оказаться слишком высокой. [c.164]

Процедура ДНК-гибридизации состоит в следующем. ДНК-мишень подвергают денатурации и одноцепочечные молекулы необратимо пришивают к твердой подложке (нитроцеллюлоз-ному или найлоновому фильтру). Эту процедуру обычно проводят при высокой температуре. Затем фильтр инкубируют с одноцепочечным ДНК-зондом, меченным радиоизотопом или другой меткой. Если нуклеотидные последовательности зонда и ДНК-мишени комплементарны, то происходит их спаривание (т. е. гибридизация) (рис. 4.11). Гибридные молекулы можно [c.65]

В диагностических тестах, основанных на гибридизации нуклеиновых кислот, ключевыми являются три компонента ДНК-зонд, ДНК-мишень и метод детекции гибридизационного сигнала. Система детекции должна быть в высшей степени специфичной и высокочувствительной. [c.187]

Нерадиоактивные методы детекции В большинстве лабораторий для гибридизации используют зонды, меченные каким-либо радиоактивным изотопом, чаще всего Р. Такие зонды обладают высокой удельной радиоактивностью и обеспечивают хорошее отношение сигнал/шум. Радиоактивно меченный зонд наносят на фильтр с фиксированной на нем ДНК-мишенью, проводят гибридизацию, отмывают несвязавшуюся ДНК-зонд и детектируют метку с помощью радиоавтографии. [c.190]

ДНК, для направленных мутаций изолированных ДНК, а также в качестве зондов при гибридизации и в качестве линкеров, облегчающих клонирование. [c.80]

Олигонуклеотиды, синтезированные химическими методами, находят широкое применение в молекулярной биотехнологии. Их используют в качестве зондов при ДНК-гибридизации, линкеров, соединяющих разные молекулы ДНК в экспериментах по клонированию, праймеров при секвенировании ДНК или осуществлении сайт-специфического мутагенеза клонированных генов-мишеней. [c.85]

На чашку Петри с бактериальными колониями накладывают лист специального нейлонового фильтра на него переходит часть клеток бактерий каждой колонии, тогда как другая часть остается на чашке. В результате получается реплика на чашке и на фильтре колонии распределены одинаково. ДНК прочно связывается (иммобилизуется) с нейлоновым фильтром. Для лизиса бактерий и денатурации ДНК клонов нейлоновый фильтр обрабатывают щелочью. Затем фильтр помещают в раствор, содержащий меченый зонд (кДНК или мРНК, или синтетический олигонуклеотид). При гибридизации зонд связывается с теми колониями, которые содержат последовательности, комплементарные меченому зонду фильтр отмывают от несвязавшихся молекул зонда и проводят радиоав- [c.46]

Рекомбинантные ДНК могут быть широко использованы для выявления возбудителей методом молекулярной гибридизации. Этот метод позволяет быстро и точно диагностировать инфекционные болезни, может использоваться для пренатального диагноза генетических дефектов, выявления животных — носителей возбудителя. Метод основан на использовании зондов — ДНК, меченных радиоактивными соединениями или биочипами, с последующей гибридизацией зондов с образцами ткани животного — носителя возбудителя болезни. Это особенно ценно для выявления скрытых инфекций (хламидиозы, медленные инфекции). Использование молекулярных зондов на основе ДНК позволяет идентифицировать близких по своим свойствам возбудителей. [c.254]

Использование РНК-зондов в блот-гибридизации по Саузерну, по-видимому, увеличивает чувствительность метода — главным образом из-за отсутствия конкурентной гибридизации зонда на себя , препятствующей гибридизации зонд—мищень (такая же чувствительность может быть достигнута и при использовании кДНК или других одноцепочечных ДНК-зондов но такие зонды, как правило, сложнее получить). [c.29]

Сначала клетки обрабатывают колцемидом, чтобы заблокировать образование веретена зто приводит к накоплению метафазных клеток в культуре. Такие клетки имеют более округлую форму и слабее прикреплены к пластику, чем другие клетки популяции, поэтому при встряхивании флакона они легко отделяются от субстрата. Метафазные клетки затем обрабатывают гипотоническим раствором (что приводит к их набуханию), после чего фиксируют в смеси метанол — уксусная кислота. Когда суспензию таких клеток по каплям наносят на предметное стекло, клетки лопаются и хромосомы расправляются на стекле по мере высыхания раствора. Реактивы для этой процедуры приведены в табл. 8.12, а сам метод описан в табл. 8.13. На следующем этапе хромосомы обрабатывают РНКазой, чтобы исключить гибридизацию зонда с хромосомной РНК, и затем уксусным ангидридом, который ацетилирует хромосомные белки и тем самым еще более уменьшает неспецифическое связывание зонда. Хромосомную ДНК денатурируют нагреванием и гибридизуют с зондом, предварительно меченным I- TP. Избыток меченого зонда удаляют серией промывок в низкосолевом буферном растворе и покрывают препарат фотоэмульсией. После необходимой экспозиции выявляют участки образования зерен серебра, соответствующие сайтам амплификации гена. Необходимые реагенты приведены в табл. 8.14, а сама процедура описана в табл. 8.15. [c.266]

Другой практический вопрос, который следует решать с учетом статистической значимости гомологий - выбор размеров зонда и условий гибридизации при скрининге библиотек генов. Для локализации генов при скрининге стараются использовать зонд, комплементарный нужному участку генома, - в этом случае проходит гибридизация зонд-ген. Однако выбранный зонд может случайно оказаться комплементарен (или почти комплементарен) и другим участкам генома - в этом случае гибридизация будет идти не только с локализуемым геном и процесс скрининга значительно осложнится (Певзнер,Миронов,19876). Если вы хотите облегчить эксперименальную работу и исключить неспецифическую гибридизацию, скажем, в 99% случаев, вам нужно знать статистические характеристики гомологии между зондом и геномам. [c.38]

Гибридизация зонда с комплементарными последовательностями геномных (клонированных или амплифицированных путем ПЦР) ДНК- Если в гибридизуемой ДНК имеется замена нуклеотида, образующие РНК—ДНК-дуплексы содержат однонуклеотидные неспаренные участки. [c.124]

Ряс. 7-23. Диаграммы гибридизации зонда из ДНК хлоропластов шпината с митохондриальной ДНК и ДНК хлоропластов из цуккини, кукурузы, шпината и гороха (задача 7-35). Столбики с индексом М относятся к митохондриальным ДНК с индексом Х -к ДНК хлоропластов. Рестрикционные фрагменты, с которыми гибри-дизовалась стандартная ДНК, показаны как темные полосы. [c.97]

Следует заметить, что иммуноанализ с регистрацией аналитического сигнала амперометрическим методом предложен сравнительно недавно. Наиболее многообещающие результаты достигнуты в тех случаях, когда датчики разрабатывались с учетом специфических требований электрохимического детектирования, а не приспосабливались к существующим методикам. В частности, большие надежды возлагаются на амперометрические зонды для диагностики генетических заболеваний (ДНК-зонды). Разработана конструкция датчика, состоящего из стеклоуглеродного электрода, поверхность которого модифицирована ковалентно пришитой односпиральной ДНК. После ее гибридизации с ДНК-мишенью регистрируют концентрацию дипиридильного комплекса Со(Ш), который взаимодействует с двойной спиралью ДНК. При генетических нарушениях односпиральная ДНК не способна гибридизоваться с ДНК, взятой у больного человека. [c.508]

Следующий после создания библиотеки этап -это поиск клона (клонов), несущего искомую последовательность ДНК. Для этого используют три широко известных метода гибридизацию с меченым ДНК-зондом с последующим радиоав-тографическим анализом, иммунологический скрининг и скрининг по активности белка, кодируемого геном-мишенью. [c.64]

Рис. 4.11. ДНК-гибридизация. Исследуемую ДНК подвергают денатурации и фиксируют на твердой подложке, например на нитроцеллюлозном или найлоновом фильтре. Меченый ДНК-зонд (обычно длиной от 100 до 1000 п. н.) тоже денатурируют, наносят на фильтр с исследуемой ДНК и проводят их отжиг. Для удаления негибри-дизовавшегося ДНК-зонда фильтр промывают и визуализируют метку. Если гибридизация между зондом и исследуемой ДНК не произошла, то никакой метки на фильтре не обнаруживается. (Метка на рисунке обозначена цветной звездочкой.)

Зонды получают разными способами. Один из них состоит в следующем. ДНК патогенного микроорганизма расщепляют с помощью рестрицирующей эндонуклеазы и клонируют в плазмидном векторе. Затем проводят скрининг рекомбинантных плазмид с использованием геномной ДНК как патогенного, так и непатогенного штаммов. Те плазмиды, которые содержат последовательности, гибридизующиеся только с ДНК патогенного штамма, составляют основу видоспецифичных зондов. После этого проводят ряд дополнительных гибридизаций с ДНК, выделенными из различных организмов, чтобы удостовериться, что потенциальные зонды не дают с ними перекрестной гибридизации. Для определения чувствительности метода каждый из зондов проверяют также на модельных образцах, в том числе и на смешанных культурах. [c.188]

Смотреть страницы где упоминается термин Гибридизация ДНК зонды: [c.192] [c.193] [c.458] [c.282] [c.14] [c.150] [c.150] [c.307] [c.33] [c.215] [c.117] [c.188] [c.151] [c.13] [c.111] [c.228] [c.65] [c.65] [c.104] [c.160] [c.188] [c.189] [c.189] [c.189]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология