Справочник химика 21

Химия и химическая технология

Статьи Рисунки Таблицы О сайте English

Клонирование и скрининг

    Зонды для скрининга геномной библиотеки можно получить по крайней мере двумя способами. Во-первых, можно использовать клонированную ДНК близкородственного организма (гетерологичный зонд). В этом случае условия гибридизации нужно подбирать таким образом, чтобы она могла происходить при существенном расхождении между нуклеотидными последовательностями зонда и искомой ДНК это позволяет решить проблемы, связанные с заведомым различием между ДНК - источником зонда и исследуемой ДНК. Во-вторых, зонд можно получить методом химического синтеза, основываясь на известной аминокислотной последовательности белкового продукта искомого гена. [c.67]


    Иммунологический скрининг В отсутствие ДНК-зонда для скрининга геномной библиотеки можно использовать другие методы. Например, если клонированный ген экспрессируется, то его продукт - весь белок или его часть - можно обнаружить иммунологиче- [c.67]

    Для скрининга библиотек на основе фага X можно использовать ДНК-зонды или иммунологические методы. Зоны лизиса (бляшки) переносят на фильтр и соответствующим образом тестируют. Если используется ДНК-гибридиза-ция, то вначале удаляют фаговые белки, затем ДНК денатурируют и фиксируют на фильтре. При тестировании иммунологическим методом белки, кодируемые клонированными генами. [c.74]

    Основой развития фармацевтической промышленности до недавнего времени был скрининг микроорганизмов и синтетических химических веществ. Появление новейших методов химического синтеза генов, возможно, позволит пойти другим путем конструирования случайных нуклеотидных последовательностей, их клонирования и оценки биологической активности соответствующих белков и пептидов. Хотя занятие это можно уподобить написанию сонета Шекспира группой печатающих [c.321]

    Через 1—2 дня добавляют необходимую селективную среду (в зависимости от того, какой из доминантных маркеров был использован). Трансформанты фибробластов можно видеть примерно через 7 дней после добавления ДНК. Их изолируют [при наличии достаточного количества клеток (от 100 до 1000)] с помощью цилиндров для клонирования (отрезки стеклянной трубки с размерами 2x1 см). Можно также наращивать трансформанты в большом количестве и далее подвергать их скринингу на нужный фенотип. [c.42]

    Процесс биосинтеза одного антибиотика может состоять из 10-30 ферментативных реакций, так что клонирование всех генов его биосинтеза -задача не из легких. Один из подходов к выделению полного набора таких генов основан на трансформации одного или нескольких мутантных штаммов, не способных синтезировать данный антибиотик, банком клонов, созданным из хромосомной ДНК штамма дикого типа. После введения банка клонов в мутантные клетки проводят отбор трансформантов, способных синтезировать антибиотик. Затем выделяют плазмидную ДНК клона, содержагцего функциональный экспрессирующийся ген антибиотика [т. е. ген, восстанавливающий (комгглементиру-ющий) утраченную мутантным штаммом функцию], и используют ее в качестве зонда для скрининга другого банка клонов хромосомной ДНК штамма дикого типа, из которого отбирают клоны, содержащие нуклеотидные последовательности, которые перекрываются с последовательностью зонда. Таким образом идентифицируют, а затем клонируют элементы ДНК, примыкающие к комплементирующей последовательности, и воссоздают полный кластер генов биосинтеза антибиотика. Описанная процедура относится к случаю, когда эти гены сгруппированы в одном сайте хромосомной ДНК. Если же гены биосинтеза разбросаны в виде небольших кластеров по разным сайтам, то нужно иметь по крайней мере по одному мутанту на кластер, чтобы получить клоны ДНК, с помощью которых можно идентифицировать остальные гены кластеров. [c.259]


    Чтобы идентифицировать полиморфные STR-локусы, нужно прежде всего провести скрининг геномной библиотеки человека, содержащей вставки небольшого размера (примерно 1000 п. н.), используя подходящий олигонуклеотидный зонд. Для идентификации клонированных (СА),,-повторов обычно используют зонд, состоящий из 15 СА-элементов. Каждую позитивную вставку секвенируют, чтобы установить длину СА-повтора и нуклеотидные последовательности фланкирующих его участков. Чтобы определить, являются ли фланкирующие последовательности однокопийны- [c.454]

    Из фрагментов вирусных и бактериальных хромосом уже выделен целый ряд генов. Что же касается выделения специфических генов из фрагментированных эукариотических хромосом, то реализация этой процедуры все еще остается довольно сложной и трудоемкой задачей. Существует два основных подхода для получения специфических генов, подлежащих затем рекомбинации и клонированию. В одном из них, который получил название шотган (от англ. shotgun-дробовик), всю клеточную ДНК обрабатывают рестриктирующей эндонуклеазой, образующей в местах разрыва выступающие концы. Полученные фрагменты ДНК встраивают затем в плазмиды Е. соИ, раскрытые (т.е. переведенные в линейную форму) с помощью той же самой рестриктирующей эндонуклеазы. В результате образуется чрезвычайно сложная смесь, состоящая, вероятно, из тысяч разных рекомбинантных плазмид, среди которых лишь одна может содержать нужный ген. Для поиска плазмиды, несущей этот ген, разработаны специальные процедуры, которые называют скринингом. Одна из таких процедур описана в разд. 30.17. [c.983]

    Альтернативные методы скрининга космидных библиотек, описанные в гл. 3, предполагают селекцию космидных клонов с использованием феномена гомологичной рекомбинации in vivo. Остальные главы книги посвящены вопросам, связанным с экспрессией клонированных генов. Для многих белков млекопитающих удалось осуществить высокопродуктивную внутриклеточную экспрессию в Е. oli. Однако гетерологические белки, локализующиеся в цитоплазме, часто образуют трудно растворимые агрегаты, что значительно осложняет получение нативного продукта. В гл. 4 описаны эффективные способы выделения активных растворимых продуктов из нерастворимых белков цитоплазмы Е. соИ. Вероятность деградации специфическими бактериальными протеиназами многих эукариотических белков, синтезируемых в Е. oli, может быть существенно снижена, если их экспрессировать в виде гибридных белков. Такие составные белки, в которых бактериальный компонент обычно представлен -галактозидазой, можно использовать в качестве иммуногенов для получения антисыворотки и моноклональных антител к клонированному эукариотическому белковому домену. Эти вопросы >ассматриваются в двух главах — одна посвящена получению поликлональной антисыворотки, а другая — методам гибридной технологии. В последующих главах книги описаны современные эукариотические экспрессирующие системы в гл. 7 — дрожжевая, далее в трех главах — системы на основе культивируемых клеток млекопитающих и трансгенные животные. В частности, описана система экспрессии с использованием векторов, которые несут гены, обеспечивающие возможность их индуцибельной амплификации это позволяет снимать токсическое действие антибиотиков, введенных в культуральную среду. Клонированные в таком векторе гены также [c.8]

    Идеальный вектор для клонирования ДНК высших эукариот должен обладать как можно большей емкостью, чтобы можно было обойтись меньшим количеством циклов скрининга библиотеки для выделения клонированных перекрывающихся фрагментов крупного гена. В нынешнем поколении векторов наибольшей емкостью обладают космидные векторы, но используют их пока реже, чем векторы, полученные на основе фага %. Объясняется это частично непредсказуемостью поведения космидных векторов, а также существенно большей трудоемкостью методов получения космидных библиотек по сравнению с эквивалентными фаговыми библиотеками. В задачу данной главы входит описание ряда разработанных в нашей лаборатории методик, а также характерных случаев и наиболее распространенных ошибок, мешающих созданию полноценной библиотеки. Мы должны подчеркнуть, что техническая сложность проводимых экспериментов затрудняет детальный анализ всех аспектов космндного клонирования. Составленный нами свод методик должен рассматриваться лишь как руководство и допускает возможные отклонения. Однако следует иметь в виду, что не имеющие большого опыта исследователи не должны серьезно от них отклоняться до тех пор, пока не приобретут сами достаточного навыка, чтобы позволить себе импровизировать. [c.40]

    Как сказано выше, приведенные здесь методики используются для отбора уникальных космидных (или плазмидных) клонов из больших библиотек с применением генетической селекции, а не скрининга библиотек путем гибридизации колоний. Этот подход получил широкое распространение использование в качестве селекционных зондов последовательностей, клонированных в pU 8 и pU 9, позволяет выделить многие космидные клоны из библиотек мыши и человека (см., например, [5, 6, 22]). [c.82]


    Основное достоинство генетического подхода — быстрота и эффективность метода достаточно большое число экспериментов можно проводить параллельно. Поэтому не возникает нужды в повторном скрининге, что делает этот метод особенно удобным там, где требуется повторное выделение многих космид (например, при прогулке по хромосоме ). Другое преимущество генетического метода — очень высокая чувствительность гомологичной рекомбинации к ошибочному спариванию последовательностей [25, 26], Данное обстоятельство может быть особенно удобным, например, при выделении космид, содержащих конкретные копии тех или иных семейств генов, или в экспериментах по прогулке по хромосоме . Такие эксперименты упрощаются при работе с некоторыми из наших новых векторов (Эрих и др., в печати), содержащих ЫоИ-сашы, фланкирующие инсерционный сайт, что позволяет провести быстрое и избирательное клонирование концевых фрагментов вставки в производных риС18 или рЕМВЬ18, содержащих 7Уо/1-сайты в полилинкере. [c.84]

    Имеются антитела к белку (белкам), с помощью которых путем скрининга библиотеки экспрессирующихся клонов (например, клонированных в Xgtll) выделен предположительно соответствующий клон ДНК. Задача сводится к проверке этого [c.141]

    В том случае, когда ожидается с высокой вероятностью экспрессия клонированного гена, методы скрининга рекомбинантных клонов основываются либо на изменении фенотипа клетки под влиянием вновь синтезированного белка, либо просто на свойствах самого белка. Например, если необходимо изолировать гены Е. соИ, ответственные за биосинтез какой-либо аминокислоты, то отбирают рекомбинантные клоны, трансформируя гибридные плазмиды в ауксотрофные по биосинтезу аминокислот мутанты и получая прототрофные клоны. Это и есть тест на комплем 1и тацию. Прием очень удобный, но он исполь зуетея-ТУбычнопри самоклонировании , т. е. при переносе генов на многокопийных плазмидах в тот же микроорганизм, и требует наличия штаммов с хорошо охарактеризованными мутациями искомых генов. [c.154]

    Клетки нз всех лунок, оказавшиеся при скрининге положительными, надо субкультивпровать. Для этого переносите содержимое этих лунок в 24-луночиый планшет и добавьте в каждую лунку по 0,5 мл свежей среды. Клетки из такого планшета могут служить источником для клонирования клеток данной гибридомной линии кроме того, их можно рассеять на чашке Петри диаметром 90 мм и заморозить. Если слияние оказалось очень удачным, можно сразу не справиться с размножением и клонированием слишком большого количества клеток. В такой ситуации лучше выбрать только пять или десять положительных колоний для немедленного их размножения, а остальные заморозить до проведения дальнейших исследований. После размножения колоний в планшете с 24 лунками скрининг следует повторить и, кроме того, провести и более жесткий скрининг другим способом. Если в результате слияния во многих лунках наблюдается рост клеток и обнаруживаются антитела к -галактозидазе, но не обнаруживается антител к белковому продукту встроенного фрагмента, тогда единственно, что остается делать, — это повторить слияние в тех же условиях, в которых проводилось предыдущее. Если, однако, в результате слияния вообще образуется небольшое число клонов гибридных клеток, тогда стоит попробовать внести изменения в методику слияния. К ним относятся использование так называемого питающего слоя для роста клеток и внесение в среду добавок. [c.192]

    Метод трансформации сферопластов используется наиболее широко и обеспечивает относительно высокий уровень трансформации. Это обстоятельство может иметь большое значение прн скрининге библиотеки, клонированной в дрожжах. Однако для отбора нескольких трансформантов при субклонировапии [c.229]

    Для решения целого ряда задач желательно иметь способ, позволяющий легко выделять рекомбинантный провирус из инфицированных клеток путем молекулярного клонирования. В частности, это относится к использованию ретровирусных векторов для удаления интронов, так как клонирование провируса дает возможность после инфекциононго цикла получать кДНК-копии интересующего нас гена. Кроме всего прочего клонирование провируса наилучшим образом позволяет исследовать и подтвердить генетическую структуру любой ретровирусной конструкции после того, как она претерпела цикл вирусной репликации. Клонирование провирусов включает обычные генноинженерные манипуляции, в том числе создание геномной библиотеки и ее скрининг гибридизационными методами. Однако заметим, что это непростая задача ввиду того, что обычно лишь одна копия искомого провируса присутствует в клеточном геноме. [c.300]

    ES- и ЕК-клетки представляют собой плюрипотентные эмбриональные стволовые клетки, предшественники которых были взяты из бластоцисты [4,5]. ES-клетки можно культивировать in vitro и после необходимых манипуляций вернуть в живой организм, инъецируя их в бластоцисту. Клетки колонизируют эмбрион и участвуют в его нормальном развитии, давая начало клеткам всех типов соматических тканей и нередко клеткам зародышевого пути [6]. Прежде чем инъецировать в бластоцисту, в ES-клетки вводят клонированные гены —либо путем трансфекции [7], либо инфицируя их рекомбинантными ретровирусами [8]. Практическое достоинство этой методической схемы состоит в том, что она дает возможность проводить селекцию или скрининг трансформированных ES-клеток на определенный же- [c.310]

    Методы, используемые для встраивания генов в pBinl9, применимы ко многим другим трансформирующим векторам растений общего типа, за исключением, может быть, возможности скрининга на X-GAL/ИПТГ, которую дают не все векторы. Кроме очевидных различий в сайтах узнавания рестриктазами, используемыми для клонирования, и в маркерах устойчивости к антибиотикам, используемых для селекции трансформантов Е. соН и агробактерий — трансконъюгантов, важно иметь в виду и присутствие в трансформирующем векторе растений последовательностей ДНК, необходимых для его мобилизации подхо- [c.35]

    Этот штамм несет мутацию 1ас , в результате чего возможен фенотипический скрининг на присутствие вставок при клонировании в плазмидах, содержащих соответствующие la Z конструкции, такие, как в pBinl9 и pU 18. [c.67]

    Сложные ростовые потребности большинства клеток млекопитающих создают определенные проблемы в оценке адекватности тест-систем, используемых для определения оптимальных ростовых сред. Более подробно эта проблема рассмотрена в обзоре Хэма [7]. Как правило, длительные (в течение нескольких суток) тесты на размножение клеток предпочтительнее, чем короткие тесты с включением Н-тимидина при оценке клеточной пролиферации, поскольку известен ряд артефактов, стимулирующих пролиферацию клеток [15]. Тем не менее метод оценки включения Н-тимидина часто используется для скрининга, но полученные результаты следует проверять с помощью теста на эффективность клонирования или просто путем подсчета клеток. [c.45]

    В этой главе мы подробно опишем методы, используемые нами в настоящее время для конструирования и скрининга космидных библиотек, а также для опытов типа прогулка вдоль хромосомы . Прогулка вдоль хромосомы определяется как метод, используемый для выделения фрагментов ДНК, соседних с данным районом клонированной ДНК. В большинстве случаев такая прогулка осуществляется с помощью скрининга геномных библиотек, полученных из частично гидролизованной ДНК, с использованием меченого уникального рестрикционного фрагмента, выделенного из концевой области клонированного района. Таким образом получают клоны, содержащие перекрывающиеся фрагменты ДНК, и после рестрикционного картирования и соответствующей ориентации фрагментов материал этих клонов может использоваться для продолжения такой прогулки . [c.17]


Смотреть страницы где упоминается термин Клонирование и скрининг: [c.60]    [c.89]    [c.103]    [c.115]    [c.209]    [c.336]    [c.424]    [c.477]    [c.139]    [c.175]    [c.183]    [c.43]    [c.43]    [c.10]    [c.175]    [c.177]    [c.108]    [c.113]    [c.108]    [c.113]    [c.26]    [c.195]    [c.36]    [c.48]   
Смотреть главы в:

Анализ генома -> Клонирование и скрининг

Анализ генома Методы -> Клонирование и скрининг


Анализ генома (2001) -- [ c.108 , c.111 ]

Анализ генома Методы (1990) -- [ c.108 , c.111 ]




ПОИСК







© 2025 chem21.info Реклама на сайте