РНК-зонды полноразмерные

Метод получения высокоспецифичных полноразмерных РНК-зондов приведен в табл. 1.2, а метод определения включения нуклеозидтрифосфатов в РНК — в табл. 1.3. [c.21]

Рис. 4.12. Получение меченого ДНК-зонда методом случайных праймеров. К денатурированной двухцепочечной ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, которую предполагается использовать в качестве зонда, добавляют гексануклеотиды (смесь всех возможных комбинаций из шести нуклеотидов) и отжигают смесь. Некоторые из олигонуклеотидов гибридизуются с немеченой денатурированной ДНК, и в присутствии фрагмента Кленова и четырех с1НТР (один из которых меченый [ ]) служат затравкой для синтеза комплементарной цепи. После денатурации синтезированной ДНК получают смесь меченых фрагментов ДНК, которые вместе составляют практически полноразмерную исходную ДНК-матрицу.

К сожалению, никто не может дать гарантии, что в библиотеке представлена вся нуклеотидная последовательность нужного гена. Если поиск полноразмерного гена оказался безрезультатным, можно создать другую библиотеку, используя другую рестриктазу, и провести скрининг с помошью исходного зонда или зондов, созданных на основе предыдущей библиотеки. Чтобы повысить вероятность присутствия в библиотеке полной версии искомого гена, можно также создать библиотеки, содержащие фрагменты ДНК заведомо большего размера, чем средний размер прокариотического гена (этот вариант мы рассмотрим в данной главе позже). [c.67]

Начиная с 1980 г. в Патентные ведомства всего мира было подано более 5000 заявок на полноразмерные гены, примерно на 1500 из них были выданы патенты. Наиболее значимым патентом, выданным на способ получения продукта с использованием гена человека, можно считать патент на способ получения рекомбинантного эритропоэтина, который принес заявителю за один только 1996 г. доход более 1 млрд. долларов. Эритропоэтин стимулирует образование эритроцитов и используется для предупреждения анемии у больных с почечной недостаточностью, которые подвергаются диализу. Множество других запатентованных нуклеотидных последовательностей используются в качестве диагностических зондов (биомаркеров). [c.537]

Реакция транскрипции, катализируемая полимеразами 5Р6 и Т7, чувствительна к концентрации рнбонуклеозидтрифосфа-тов. При низких концентрациях полимеразная реакция имеет тенденцию к преждевременной терминации и образованию неполных транскриптов. Полноразмерные транскрипты обычно образуются, когда концентрация нуклеотидов превышает 250 мкМ. В принципе при получении радиоактивных зондов стремятся к получению максимальной удельной радиоактивности путем увеличения удельной радиоактивности нуклеозидтри-фосфата-предшественника. В то же время очевидно, что при работе с нуклеозидтрифосфатами в концентрации 250 мкм нереально использовать меченые предшественники с высокой [c.21]

При гель-электрофорезе меченых транскриптов было обнаружено, что сами матрицы различаются по способности давать полноразмерные транскрипты. Даже в условиях такой низкой концентрации нуклеозидтрифосфатов, как 4 мкМ, при использовании в качестве матрицы ДНК гена hprt-ыышк синтезируется значительное количество полноразмерной РНК-зонда, тогда как на ДНК гомео-бокса при концентрации нуклеозидтрифосфатов 15 мкМ полноразмерных транскриптов почти не синтезируется (И. Дж. Джексон, неопубликованные данные). [c.24]

При гель-электрофорезе транскриптов, образовавшихся в условиях преждевременной терминации, как правило, не обнаруживается дискретных больших фрагментов. Л ежду тем некоторые последовательности, по-видимому, содержат внутренние слабые сайты терминации в результате в геле обнаруживаются полосы, соответствующие достаточно большим, но неполноразмерным траискриптам. Количество таких полос уменьшается по мере возрастания количества полноразмерных транскриптов при использовании более высоких концентраций нуклеотидов, но даже при самых высоких концентрациях они никогда не исчезают полностью. Именно эти дискретные продукты, получающиеся в результате преждевременной терминации, служат основным источником трудностей прн анализе результатов опытов по защите от действия РНКазы. Следовательно, требуется проводить анализ меченого зонда с помощью гель-электро-фореза до его использования, особенно в случае экспериментов по защите от РНКазы. [c.24]

Вестерн-блот-анализ гибридного белка Gal.T.HA, при котором в качестве зонда использовались моноклональные антитела к большому Т-антигену, показал, что гибридный белок подвергался деградации по всей длине. Например, антитело РАЬ423 (рис. 6.3), узнающее эпитоп, расположенный в С-концевом участке большого Т-антигена, связывается только с полосой на электрофореграмме, соответствующей белку с самой большой молекулярной массой, т. е. полноразмерным гибридным белком. Антитело РАЬ204, узнающее эпитоп, занимающий участок между аминокислотами 453 и 469 [5], взаимодействует с разными полосами, которые соответствуют как полноразмерным белковым продуктам, так и полипептидам с меньшей молекулярной массой, чем -галактозидаза. [c.178]

Гаплоидный геном лабораторных штаммов S. erevisiae содержит примерно 35 Ту-элементов, что составляет 1% всего генома. У других штаммов дрожжей число копий Ту меньше. Помимо полноразмерных Ту-элементов, у S. erevisiae имеется примерно 100 одиночных 6-сегментов, не имеющих отношения к Ту-элементам. Гибридизация клонированных Е-зондов с рестрицированной геномной ДНК из разных штаммов дрожжей говорит о том, что гомологичные сегменты различаются по числу копий и по размерам это согласуется с представлением о нефиксированной локализации Ту-элементов. [c.249]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология