Гель-электрофорез

ДНК-зонды применяют для поиска родственных генов в реакциях гибридизацрш с РНК — для выявления экспрессии данного гена в различных клетках. Для вьывления молекул нуклеиновых кислот, комплементарных всему зонду (или его участку), ДНК-зонды часто сочетают с методом гель-электрофореза, что позволяет получать информацию о размерах гибридизируемых молекул ДНК. Эффективное использование современных приборов, способных автоматически синтезировать любые нуклеотидные последовательности за короткий промежуток времени, дало возможность перестраивать гены, что представляет собой один из важных аспектов генной инженерии. Обмен генами, а также введение в клетку гена другого вида организма осуществляют посредством генетической рекомбинации in vitro. Этот подход был разработан на бактериях, в частности на Е. соИ. Он основан на важном свойстве ДНК — способности к перестройкам, изменяющим комбинацию генов в геноме и их экспрессию. Такая уникальная способность ДНК позволяет приспосабливаться данному виду к изменяющейся среде. Генетическую рекомбинацию подразделяют на два больших класса общую рекомбинацию и сайт-специфическую рекомбинацию. В процессе общей рекомбинации генетический обмен в ДНК происходит между гомологичными нуклеотидными последовательностями, например между двумя копиями одной и той же хромосомы в процессе мейоза (кроссинговера), или при скрещивании и перегруппировке генов у бактерий. [c.112]

Гель-электрофорез. Электрофорез на геле и крахмале применяют для аналитических целей. Наиболее важным применением гель-электрофореза является иммуноэлектрофорез. Для этого вида анализа используют макропористые гели, в частности гели агара и агарозы. Метод иммуноэлектрофореза основан на том, что после разделения электрофорезом происходит диффузия разделенных веществ — антигенов — в направлении, перпендикулярном направлению электрофореза. Навстречу этим соединениям диффундируют антитела. При соединении антигенов и антител образуются характерные дуги осаждения. Метод иммуноэлектрофореза очень чувствителен при обнаружении антигенов, специфических для данных антител. В настоящее время применяют метод введения радиоактивной метки в антигены, благодаря чему радиоиммуноэлектрофорез является одним из самых чувствительных методов анализа биополимеров. [c.364]

Аминокислотный состав и последовательность аминокислот выяснены для многих тысяч белков. В связи с этим стало возможным вычисление их молекулярной массы химическим путем с высокой точностью. Однако для огромного количества встречающихся в природе белков химическое строение не выяснено, поэтому основными методами определения молекулярной массы все еще остаются физико-химические методы (гравиметрические, осмометрические, вискозиметрические, электрофоретические, оптические и др.). На практике наиболее часто используются методы седиментационного анализа, гель-хроматография и гель-электрофорез. Определение молекулярной массы белков методами седиментационного анализа проводят в ультрацентрифугах , в которых удается создать центробежные ускорения [c.44]

Один из этих подходов состоит в локализации ковалентных сшивок между нуклеосомиыми гистонами и ДНК. Принцип локализации заключается в том, что сшитые комплексы белков с ДНК разделяют в двумерных гель-электрофорезах, причем после электрофореза первого направления в геле расщепляют белковый или нуклеиновый компонент комплексов и разделяют во втором направлении только ДНК или только белки соответственно. Таким образом была получена карта линейного расположения гистонов на ДНК (рис. 125). Гистоны НЗ, Н4 располагаются в центре нук-леосомной ДНК, в то время как гистоны Н2А, Н2В локализованы на периферии. Гистон НЗ взаимодействует с центральным и концевым участками нуклеосомной ДНК. Хотя эти участки на развернутой ДНК расположены далеко друг от друга, они сближаются на свернутой в нуклеосому ДНК и, видимо, с ними взаимодействует одна и та же молекула гистона НЗ. На этой же карте видно, что не вся ДНК сплошь покрыта гистонами, а есть свободные от взаимодействия сегменты, например первые 20 нуклеотидов от 5 -концов обеих цепей нуклеосомной ДНК и участки, расположенные на расстоянии около 120 нуклеотидов от 5 -концов. Внутри нуклеосомы гистоны находятся в тесном контакте друг с другом, о чем свидетельствует образование почти всех возможных [c.240]

Заряженные частицы перемещаются в растворе под влиянием электрического поля с различной скоростью. Уже в первой половине нашего столетия для этого явления было введено понятие "электрофорез" или "электрический перенос". Различие скоростей перемещения может быть обусловлено двумя причинами (а) различные молекулы несут на себе различные заряды и поэтому при наложении электрического поля могут ускоряться в различной степени (б) их перемещению препятствует различающееся по величине сопротивление трения. В простейшем случае разделительная среда (раствор электролита) находится в трубке. Из-за отвода Джоулева тепла на практике зачастую наблюдается искажение зон за счет различных плотностей электролита и конвекционных потоков. В случае классического электрофореза применяются гели или полоски бумаги, пропитанные электролитами для того, чтобы уменьшить помехи, вызванные конвекцией, а также чтобы увеличить сопротивление трения макро-молекул с незначительными различиями в зарядах и тем самым усилить эффект разделения. Использование полиакриламидного гель-электрофореза (ПААГ-электрофореза) позволяет проводить эффективное разделение молекул ДНК и белков. Благодаря изменению степени сшивания геля может быть оптимизирована производительность разделения. При использовании гель-электрофореза белков, денатурированных додецилсульфатом натрия (ДДСН), возможно непосредственное определение их молекулярной массы. Разделение в этом случае основано исключительно на затруднении миграции пробы через гель (без геля все денатурированные додецилсульфатом натрия белки перемещаются с одинаковой скоростью). [c.5]

Паспорт-инструкция к использованию аппарата для вертикального гель-электрофореза. Таллинн, 1984 [c.101]

Кроме ферментов в ядрах содержатся негистоновые белки, имеющие, по-видимому, отношение к структуре хроматина. К ним относятся так называемые H.MG-белки, принадлежащие к двум классам HMQ 14 и 17 и H.MG 1 и 2. (Название H.MQ-белков происходит от англ. high mobility group — группа [белков с высокой подвижностью, так как в обычных системах гель-электрофореза эти белки движутся быстрее других негистоновых белков хроматина.) Эти белки содержат много положительно и отрицательно заряженных аминокислотных остатков, причем они располагаются асимметрично iV-концевая часть богата кислыми остатками, а С-концевая — основными. Возможно, HMG-белки участвуют в процессах транскрипции и репликации. [c.238]

Одним из наиболее изученных 4 ферментов, множественность форм которого детально изучена методом гель-электрофореза, является ЛДГ, катализирующая обратимое превращение пировиноградной кислоты в молочную. Пять изоферментов ЛДГ образуются из 4 субъединиц примерно одинакового размера, но двух разных типов. Поскольку Н-протомеры несут более выраженный отрицательный заряд при pH 7,0—9,0, чем М-про-томеры, изофермент, состоящий из 4 субъединиц Н-типа (Н,), при электрофорезе будет мигрировать с наибольщей скоростью в электрическом поле к положительному электроду (аноду). С наименьщей скоростью будет продвигаться к аноду изофермент М в то время как остальные изоферменты будут занимать промежуточные позиции. Следует подчеркнуть, что изоферменты ЛДГ, обладая почти одинаковой ферментативной активностью, различаются некоторыми физико-химическими свойствами молекулярной массой, электрофоретической подвижностью, отнощением к ак- [c.128]

ПААГ-электрофорез - полиакриламидный гель-электрофорез [c.111]

Пожалуй, самым ценным новым методом определения молекулярного веса является гель-электрофорез в присутствии денатурирующего [c.182]

Получение Н.к. В клетках Н.к. связаны с белками, образуя нуклеопротеиды. Выделение Н.к. сводится преим. к очистке их от белков. Для этого препараты, содержащие Н.к., обрабатывают ПАВ и экстрагируют белки фенолом. Послед, очистка и фракционирование Н.к. проводятся с помощью ультрацентрифугирования, разл. видов жидкостной хроматографии и гель-электрофореза. Для получения индивидуальных Н.к. обычно используют разл. варианты последнего метода. [c.299]

В середине 1960-х годов начались исследования нуклеотидных последовательностей РНК. Первыми были определены первичные структуры тРНК (Р. Холли и сотр., 1965 А. А. Баев и сотр., 1967). Развитие техники фракционирования фрагментов нуклеиновых кислот и прежде всего гель-электрофореза (Ф. Сэнгер и сотр.) позволило в начале 1970-х годов приступить к изучению первичной структуры высокомолекулярных РНК. В 1976—1978 гг. были созданы исключительно быстрые и эффективные методы секвени-рования ДНК и РНК (А. Максам и У. Гилберт, Ф. Сэнгер и сотр.), которые позволили за короткое время получить огромную информацию о первичной структуре генов, их регуляторных элементах, вирусных и рибосомных РНК и т. д. [c.7]

Классический электрофорез (гель-электрофорез или электрофорез на бумаге) имеет две характерные особенности. Во первых, количественный анализ возможен только с [c.5]

В идеальном случае все четыре расщепления регулируют таким образом, чтобы получать один разрыв на цепь ДНК- Это далее позволяет идентифицировать основания прямым анализом авторадиограммы гель-электрофореза четырех одновременно исследуемых образцов. Аденин обнаруживается в виде более темной Полосы в продуктах второй реакции (А>0), по сравнению [c.191]

Моно- и ОЛИ ногу клеосомы можно выделить, например, центрифугированием в градиенте сахарозы продуктов расщепления хроматина нуклеазой. Еще более тонкое фракционирование хро-матиновых частиц получают с помощью гель-электрофореза, при котором разделяются нуклеосомы с разной длиной линкера или различающиеся по белковому составу. [c.244]

Гель-электрофорез проводится в агарозном или полиакриламидном геле. Это исключительно гибкий метод разделения варьируя структуру геля и состав буферного раствора, можно проводить разделение на основе различия в молекулярных массах, изоэлектрических точках и биоспецифическом сродстве. Особенно высокого разрешения достигают при гель-электрофорезе в полиакриламиде [39], так как здесь дополняют друг друга электрофорез и молекулярноч итовой эффект. Сыворотка, например, расщепляется на 20 полос, в то время как при электрофорезе в агарозе появляется лишь 5 полос. [c.351]

Длины фрагментов определяют с помощью высокоразрешающего электрофореза в тонком слое пшиакриламидного геля. Электрофорез проводится при повышенной температуре в буферной систе.ме, содержащей 7 М мочевину, что способствует разрушению вторичной структуры фрагментов детекция зон фрагментов на электрофореграмме зависит от способа мечения его конца (если это [c.16]

Рассмотренные выше факты привели к концепции, предполагающей, что ( а++К+)-зависимая АТРаза и является, по существу, мембранным ионным нашсом. Для активации фер ментной системы ионы К+ и №+ должны находиться по разные стороны от мембраны. Вместе с тем очищенный фермент должен гидролизовать АТР в пробирке в присутствии Na++K++Mg2+. Этот бетокудалосьвыделитьвочищенном виде [53—56]. При гель-электрофорезе в присутствии додецилсульфата натрия очищенная (На++К+)-зависимая АТРаза разделяется на две субъединицы. Большая из них представляет собой полипептидную цепь с мол. весом - 95 000—100 000, а меньшая является гликопротеидом с мол. весом 50 000. Антитела к изолированной большой субъединице связываются с фрагментами мембран, принадлежащими, по-видимому, участкам внутренней поверхности плазматической мембраны [57]. Логично предположить, что гликопротеидная субъединица фермента расположена на наружной поверхности мембраны. [c.362]

На заключительном этапе выделения и очистки белков исследователя всегда интересует вопрос о гомогенности полученного белка. Нельзя оценивать гомогенность индивидуального белка только по одному какому-либо физико-химическому показателю. Для этого пользуются разными критериями. Из огромного числа хроматографических, электрофоретических, химических, радио- и иммунохимических, биологических и гравитационных методов наиболее достоверные результаты при определении гомогенности белка дают ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы или хлорида цезия, диск-электрофорез в полиакриламидном геле, изоэлектрическое фоьсусирование, иммунохимические методы и определение растворимости белка. Действительно, если при гель-электрофорезе белок движется в ввде одной узкой полосы и в этой зоне сосредоточена его биологическая активность (ферментативная, гормональная, токсическая [c.32]

Н выделяют из клеток в осн. с помощью ультрацентри-ф>тиро вания и гель-электрофореза, избегая денатурирующих воздействий. [c.304]

П Гель-формование 5/236 Гель-электрофорез 3/588, 589, 600 Гель-эффект 3/840 4/308 Гем 1/1006, 1007 2/22, 279. lie-3/175, 1079 5/771, 772 Гем... 1/1005 Гемагглютинация 1/603 Гематит 2/254, 268-270, 274, 60t 3/165, 167, 633, 634, 698 4/560 Гематоксилин 2/974 Гематопорфирнн 4/145, 146, 149 Гемимеллитовая кислота 1/513, 51-3/371 [c.576]

Одним из наиболее распространенных методов фракционирования белков (как и методов оценки гомогенности) является диск-электрофорез (от англ. dis ontinuous-прерывистый, перемежающийся) в полиакриламидном геле, при котором используют пары буферных растворов с различными значениями pH и разной степени пористости гель. Следует отметить высокую разрешающую способность гель-электрофореза. Если при электрофорезе белков сыворотки крови человека на бумаге открываются всего 6 фракций, то при электрофорезе в крахмальном геле-10, а в полиакриламидном геле-до 18 разных белковых фракций. [c.31]

Наряду с КЗЭ, при котором удается осуществить разделение только за счет разницы в подвижности, и который в настоящее время представляет собой наиболее распространенный метод, выделяют также капиллярный гель электрофорез (КГЭ) с капилляром, заполненным гелем. При этом на электрофоретическую миграцию молекул оказывает влияние матрица геля, и поэтому достигается селективное разделение молекул по размерам. Незаряженные молекулы можно разделять с помощью мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ). В данном случае к буферу добавляется детергент, и нейтральные молекулы распределяются между буфером и мицеллами в соответствии с их гидрофобностью. Разделение основано на подвижности мицелл, заряженных в большинстве случаев отрицательно. Поскольку в основе разделения лежит процесс распределения, можно с полным основанием говорить о хроматографическом методе. При изоэлектрической фокусировке (ИЭФ) происходит разделение в градиенте pH, формируемом добавлением амфолита к буферу в электрическом поле. Небольшое распространение получила пока электрохроматография (ЭХ), при которой применяется стационарная среда ВЭЖХ, а течение эдюента и перенос пробы происходит только за счет электроосмотического потока. В качестве самой старой капиллярной техники следует упомянуть изотахофорез (ИТФ), который в настоящее время вновь приобрел значение для концентрирования проб в КЭ. [c.7]

Электрофорез (электрофорез без носителя, электрофорез на носителе гель-электрофорез, диск-электрофорез, изоэлектрическое фокусирование, изотахоэлектрофорез, иммуноэлектрофорез ) Ионообменная хроматография Аффинная хроматография [c.347]

Лучшим способом аналитического разделения рибосомных белков является электрофорез в геле. Уже при одномерном гель-электрофорезе в денатурируюших условиях можно получить значительное фракционирование р41босомных белков по заряду и молекулярной массе (размеру). Среди рибосомных белков большинства живых организмов преобладают умеренно основные полипептиды, хотя всегда [c.90]

Молекулярную массу белков можно также определять посредством гель-электрофореза в полиакриламиде [41]. Мономеры, предназначенные для образования геля, растворяют в буфере и полимеризуют в стеклянных трубках или между пластинками при использовании в качестве сшивающего агента бисакриламида. Большая разделяющая способность метода объясняется молекулярно-ситовым эффектом. [c.361]

В настоящее время применяют ряд усовершенствованных методов разделения нуклеиновых кислот на фракции из суммарного препарата, полученного описанным методом. Это прежде всего хроматография на геле фосфата кальция, ионообменная хроматография (в качестве адсорбентов используют ДЭАЭ-целлюлозу, ДЭЛЭ-сефадекс и др.), ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы, хроматография по сродству на белковых носителях, фильтрация через гели агарозы и сефарозы, гель-электрофорез и др. [c.97]

Полное аналитическое разрешение всех рибосомных белков достигается с помощью двумерного гель-электрофореза в денатурирующих условиях. Удобная система разделения была предложена Э. Кальт-шмидтом и Г. Виттманном они использовали 8%-ный полиакриламидный гель при pH 8,6 для электрофореза в первом направлении и 18%-ный гель при pH 4,6 во втором направлении. В этих условиях разделялись все белки 30S субчастицы и все белки 50S субчастицы Е. oli. Пример такого разделения белков обеих рибосомных частиц в слегка модифицированной системе дан на рис. 53 и 54. Первое направление электрофореза в рыхлом геле при нейтральном или слегка щелочном pH обеспечивает движение кислых и нейтральных белков влево, к аноду, в то время как основные белки мигрируют вправо, к катоду, разделяясь в основном по заряду. Второе направление электрофореза в плотно сшитом геле при кислом pH обеспечивает движение всех белков в одну сторону —к катоду (вниз), и в их разделение большой вклад вносит размер разделяемых компонентов (чем меньше, тем подвижнее). [c.91]

Ялюс -процедура включает экзонуклеолитическое расщепление синтетических фрагментов ДНК путем удаления одного за другим оснований с З -конца. Эта процедура требует применения модифицированной ДНК-полимеразы I, которую можно останавливать в определенных положениях разрушаемой последовательности добавлением одного из четырех нуклеозидтрифосфатов. Снова, проводя параллельно четыре реакции, каждая из которых наращивает один нуклеотид (+А, +С, -fG или -f-T), расщепление может быть остановлено перед одним из оснований (А, С, G или Т). Снова гель-электрофорез дает картину ряда полос, с которой можно непосредственно считывать последовательность. Эта методология иллюстрируется рис. 22.4.2. [c.189]

Молекулярная биология. Структура и биосинтез нуклеиновых кислот (1990) -- [ c.7 , c.10 , c.16 , c.17 , c.19 , c.30 , c.40 , c.238 , c.240 , c.244 ]

Биохимия Том 3 (1980) -- [ c.308 , c.352 ]

Аминокислоты Пептиды Белки (1985) -- [ c.351 ]

Молекулярная биология (1990) -- [ c.7 , c.10 , c.16 , c.17 , c.19 , c.30 , c.40 , c.238 , c.240 , c.244 ]

Биологическая химия Изд.3 (1998) -- [ c.31 , c.32 , c.74 , c.97 , c.128 ]

Молекулярная биотехнология принципы и применение (2002) -- [ c.54 ]

Хроматография Практическое приложение метода Часть 1 (1986) -- [ c.112 ]

Гены (1987) -- [ c.44 ]

Молекулярная биология клетки Т.3 Изд.2 (1994) -- [ c.216 , c.217 , c.232 ]

Методы общей бактериологии Т.3 (1984) -- [ c.0 ]

Генетика с основами селекции (1989) -- [ c.461 ]

Методы исследований в иммунологии (1981) -- [ c.95 , c.118 ]

Вирусология Методы (1988) -- [ c.41 , c.42 , c.152 , c.196 , c.284 , c.290 ]

Переключение генов (1988) -- [ c.95 , c.102 , c.123 ]

Гены и геномы Т 2 (1998) -- [ c.317 , c.320 ]

Физическая Биохимия (1980) -- [ c.228 , c.234 ]

Молекулярная биология клетки Т.3 Изд.2 (1994) -- [ c.216 , c.217 , c.232 ]

Биохимия Т.3 Изд.2 (1985) -- [ c.0 ]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология