Концевое мечение фрагментов ДНК

Рис. 20.20. Концевое мечение двухценочечных ДНК с помощью ДНК-полимеразы Т4. З -экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы катализирует отщепление 3 -концевых нуклеотидов фрагментов ДНК с тупыми концами (А), с выступающими З -концами (F) или с выступающими 5 -концами (В). Отщепление происходит до тех пор, пока на противоположной цепи не экспонируется основание, комплементарное меченому дезокси-рибонуклеотиду, введенному в реакционную смесь (dGTP ) затем включается полимеразная активность ДНК-полимеразы Е4, и к 3 -концу присоединяется свободный меченый дезоксирибонуклеотид. Метка включается в оба конца фрагментов ДНК (на рисунке это не показано). Для мечения можно использовать любой дезоксирибонуклеотид.

КОНЦЕВОЕ МЕЧЕНИЕ ФРАГМЕНТОВ ДНК [c.22]

Как уже отмечалось выше, для определения нуклеотидных последовательностей ДНК методом Максама-Гилберта необходимо наличие фрагментов ДНК, несущих на одном из концов какую-либо метку. Отдельные частные случаи секвенирования ДНК методом химической деградации (геномное и мультиплексное секвенирование, рассматриваемые в других главах) могут проводиться даже с немечеными препаратами ДНК. Концевое мечение секвенируемых фрагментов ДНК можно осуществить при помощи различных ферментов. Так, с помощью поли-нуклеотидкиназы фага Т4 и молекулы АТФ, несущей радиоактивный фосфор в у-положении, проводится мечение 5 -концов одно- или двуцепочечного фрагмента ДНК. Эффективность мечения тупых или 5 -углубленных концов двуцепочечного фрагмента ДНК значительно ниже, -чем 5 -выступающих. Для более эффективного мечения необходим предварительный этап дефосфорилирования фрагмента ДНК с помощью щелочной фосфатазы. Особая забота должна быть проявлена при последующем удалении щелочной фосфатазы, что достигается обычно фенольной депротеинизацией, так как остаточная фосфатазная активность может резко снизить эффективность этапа мечения. Мечение путем обменной реакции позволяет обойтись без этапа дефосфорилирования и требует присутствия в реакционной смеси в качестве акцептора молекул АДФ, однако эффективность мечения при этом будет значительно ниже. [c.22]

В этом наборе фрагментов меченый 5 -концевой остаток показан на красном фоне. Обратите внимание на то, что два фрагмента помечены, а это значит, что они содержат 5 -конец исходного олигонуклеотида, в то время как фрагменты Т—А—О, А—О—С—Т—А—С и А—О не содержат метки, т. е. в них отсутствует исходный 5 -конец. Нас будут интересовать только меченые фрагменты. [c.888]

Метод основан на определении концевых функциональных групп (гидроксильных, карбоксильных, аминных и др.), меченых фрагментов инициаторов (пероксидных, азосоединений и др.) или отдельных атомов в макромолекулах (хлор, бром, сера и др.). [c.201]

Для определения первичной структуры коротких олигонуклеотидов (до 15 — 20 звеньев) обычно используют метод блуждающего пятна , или сзнгерпринта . Меченный по одному из концов олигонуклеотид гидролизуется экзонуклеазой с противоположного конца в условиях неполного расщепления, так что образуется набор всех возможных фрагментов. При расположении полученных таким путем олигонуклеотидов в порядке возрастания длины каждые два соседних продукта будут отличаться друг от друга на одно концевое звено. Меченое же звено у всех олигонуклеотидов является общим (рис. (78). [c.318]

Рассмотрим последовательность только для одной нуклеосомы. При расщеплении нуклеазой микрококков образуется мономерный фрагмент, состоящий из специфической последовательности. Если выделить ДНК и расщепить ее рестриктирующим ферментом, для которого имеется только один сайт рестрикции на этом фрагменте, то ДНК будет разрезана только в одной точке. При этом образуются два фрагмента, каждый с уникальным размером. Продукты двойного расщепления нуклеазой микрококков и рестриктирующим ферментом разделяют с помощью электрофореза в геле. Для идентификации фрагментов, образованных в результате двойного расщепления, используют специальный зонд, представляющий собой последовательность ДНК, непосредственно примыкающую к сайту рестрикции (с одной стороны). Этот метод называют непрямым концевым мечением (не совсем соответствующее название). [c.377]

Совершенно очевидно, что если разделить все полученные олигонуклеотиды и для каждого из них определить концевое звено, противоположное меченому, то после расположения всех фрагментов в порядке возрастания длины можно реконструировать последовательность исходного олигонуклеотида. Таким -образом, проблема заключается в разделении продуктов и идентификации их концевых групп. [c.318]

Для концевого мечения ДНК-фрагментов -независимо от характера образующихся после эндонуклеазной обработки концов (5 -, 3 -выступающих или тупых) - можно использовать реакцию замещения, катализируемого ДНК-по-лимеразой Т4. В этом случае к препарату кос-мидной ДНК, обработанной рестриктазой, добавляют ДНК-полимеразу и один меченый дезоксинуклеотид (рис. 20.20). Под действием З -экзонуклеазной активности ДНК-полимера-зы происходит последовательное отщепление 3 -концевых нуклеотидов. Процесс продолжается до тех пор, пока в противопложной цепи не экспонируется нуклеотид, комплементарный меченому дезоксинуклеотиду, добавленному в реакционную смесь. Далее включается полимеразная активность ДНК-полимеразы, и к 3 -концу присоединяется свободный меченый нуклеотид. Поскольку другие нуклеотиды в реакционной смеси отсутствуют, дальнейшего роста цепи не происходит. [c.463]

Подобные структурные изменения хроматина могут происходить у дрожжей в области центромеры. В данном случае кажется вероятным, что вместо видимого кинетохора сама нить хроматина вьшолняет функцию центромеры. Строение центромерной области было исследовано методом непрямого концевого мечения с использованием коротких фрагментов ДНК в качестве зОпдов. С помощью зондов были идентифицированы два сверхчувствительных к ДНКазе I сайта, локализованные с обеих сторон от областей I и III. Это короткие консервативные последовательности центромерной ДНК, приведенные на рис. 28.11. Область размером 220-250 п.н. между двумя сверхчувствительными сайтами защищена от нуклеазного расщепления. [c.392]

НЕПРЯМОЕ КОНЦЕВОЕ МЕЧЕНЬЕ (indire t end labeling). Метод изучения ДНК, при котором производится разрез в определенном участке молекулы и выявляются все фрагменты, содержащие последовательность, располагающуюся только с одной стороны от данного разреза с помощью такого подхода определяют расстояния от данного разрыва в молекуле ДНК до следующего. [c.523]

Только концевой трехуглеродный фрагмент молекулы жирной кислоты с нечетным числом атомов углерода является потенциальньп субстратом для образования гликогена, поскольку только из этой части молекулы при окислении образуется пропионат. Тем не менее меченые углеродные атомы жирных кислот после прохождения через цикл лимонной [c.295]

Секвенирование больших фрагментов ДНК методом химической деградации по Максаму-Гилберту было возможно путем построения подробной рестриктазной карты клонированного фрагмента ДНК, разработки на ее основе стратегии секвенирования, заключающейся в выборе тех или иных рестриктазных фрагментов исследуемого клона, полностью перекрывающих всю длину вставки (рис. 8.1). Далее следовал этап препаративного расщепления ДНК соответствуюпщми рестрикционными эндонуклеазами, препаративный гель-электрофорез, концевое мечение элюированных фрагментов и проведение реакций химической модификации и гидролиза. Следует отметить, что данный подход к секвенированию крупных вставок методом Максама-Гилберта вполне может быть применен и в настоящее время, однако разработ- [c.234]

Проблемой, которую каждый раз приходится решать при использовании метода Максама — Гилберта, является получение полинуклеотидов, меченных только по одному из концов. Обычно для анализа используются двухцепочечные фрагменты ДНК (например, образовавшиеся после расщепления рестриктазами), а все методы введения концевых меток приводят к образованию фрагментоа, меченных по двум 5 - нлн двум 3 -концам. Поэтому приходится прибегать к дополнительным операциям, таким, как разделение комплементарных цепей ДНК после введения метки. [c.325]

ДНК-полимераза I (но не фрагмент Кленова) широко используется для получения меченых ДНК методом так называемой /шк-трансляции (от англ. ni k, обозначающего одноцепочечный разрыве). Если одна нз цепей ДНК содержит одноцепочечный разрыв так, что З -концевой нуклеотид в месте разрыва имеет З -ОН-группу, то ДНК-полимераза 1 в присутствии четырех нук-леозидтрифосфатов осуществляет матричный синтез. Одновременно она гидролизует существовавшую цепь за счет 5 З -экзоиук-леазной активности, как показано на схеме [c.350]

По мере синтеза удлиняется 5 -коицевой фрагмеит и укорачивается З -коицевой фрагмеит. В результате З -концевой фрагмент может быть полностью замещен вновь синтезированной ДНК, Если для wK-трансляции использоаать меченые трифосфаты, то синтезированная ДНК получается меченой. [c.351]

Рис. 18-1. Окисление фенилзамещенных жирных кислот (опыты Кноопа). Кнооп скармливал кроликам жирные кислоты, меченные фенильной группой при ( -углеродном атоме, т. е. при атоме углерода концевой метильной группы. При скармливании ш-фенилзамещенных жирных кислот с четным числом атомов углерода в моче животных всегда обнаруживалась в качестве конечного продукта окисления фенилуксусная кислота, а при скармливании кислот с нечетным числом атомов углерода-бензойная кислота. Из этого наблюдения Кнооп заключил, что окисление цепи жирной кислоты начинается с р-углеродного атома и протекает путем последовательного отщепления от цепи двухуглеродных фрагментов (как это показано на рисунке поперечными пунктирными линиями красного цвета). Двухуглеродные фрагменты отщепляются, вероятно, в виде ацетата, который затем окисляется до СО2 и Н2О. Остальная часть молекулы жирной кислоты (показана на красном фоне) уже более не окисляется и выводится из организма.

Теперь задача сведена к исследованию поочередно всех пептидов ферментативного гидролизата. Для этого сначала делаем аминокислотный анализ фрагментов, а затем пускаем в ход метод концевых групп Сэнгера или Эдмана. Короткие пептиды (до пентапентидов) расшифровываются сравнительно легко. Метод концевых групп может быть применен многократно и последовательно, т. е. после гидролитического отш епления меченного реагентом конца, можно действовать снова и метить следуюгцее звено с N-кoнцa пептидной цепочки. Можно также использовать карбоксипептидазу для отш епления С-конца. Комбинация этих методов позволяет однозначно расшифровать короткие пептиды за сравнительно небольшой срок. [c.27]

Помимо прямой функции — инициировать полимеризацию инициатор или смесь инициаторов может использоваться в различных аналитических целях. Преобладание реакции соединения радикалов в механизме обрыва поОгимерных цепей позволяет в некоторых-специально выбранных условиях получить продукт, концевые группы которого содержат осколки инициатора. Этот способ многократно использовался при анализе механизма полимеризации, инициируемой радиоактивно меченным инициатором. Фрагменты инициатора, содержащие карбонильные группы,четко идентифицируютсяИК-спек-троскопией. Показано [63], что в полистироле можно измерить концентрацию этих групп порядка 1 10 моль/л по характеристическим линиям 1738 и 1726 см . [c.42]

В отличие от стирола, при полимеризации метилметакрилата преобладает обрыв за счет реакции диспропорционирования двух растущих цепей. Это особенно ясно видно из исследований Бевингтона, Мел-вилла и Тейлора [13] по определению фрагментов инициатора (меченого радиоактивными изотопами) в концевых группах полиметилметакрилата. Авторы нащли для отнощения при 0°С — 1,50, при 25° С— 2,13 и при 60° С —5,75. Значение полученное при 60° С, менее надежно, главным образом из-за высокой доли диспропорционирования (относительная ошибка примерно в 10 раз больше, чем для значений при О и 25°С). С другой стороны, очевидно, что отношение Аз/ з также увеличивается с повышением температуры от 25 до 60° С. Это объясняется тем, что бимолекулярный обрыв за счет соединения двух радикалов несомненно требует значительно меньшей энергии активации, чем ди спропорционирование, при котором от одной радикальной цепи к другой переходит атом водорода. [c.230]

Установить механизм обрыва при полимеризации винилацетата экспериментально очень трудно, так как даже при относительно высоких концентрациях инициатора рост молекулярной цепи прекращается главным образом в результате реакции передачи и число молекул, образующихся при бимолекулярном обрыве, относительно мало. Поэтому неудивительно, что Бемфорд и Дженкинс [30], используя свой метод (см. стр, 231), не смогли найти для винилацетата никаких признаков обрыва за счет соединения. Мелвилл и Сьюэлл [21], однако, установили, что полимерные молекулы высшей фракции поливинилацетата, полученного при 18°С сенсибилизацией динитрилом азоизомасляной кислоты. меченым радиоактивным изотопом (конверсия 80%), содержали в среднем по 2,7 концевых групп с фрагментами инициатора. Это можно объяснить только тем, что при этой температуре обрыв, по крайней мере, частично происходит в результате соединения цепей отношение соединения к диспропорционированию в соответствии с ожидаемыми для этих реакций энергиями активации. аолжно изменяться с повышением температуры в сторону преобладания диспропорционирования. Количественная трактовка на основании имеющихся данны.ч не представляется возможной. [c.244]

При расщеплении двух идентичных генов, содержащих 5 - и З -концевые участки, образуются различающиеся фрагменты, поскольку сайты рестрикции находятся в различных участках фланкирующей ДНК. Фрагменты идентифицируют с помощью блоттинга ДНК после электрофореза и гибридизации ее с меченой кДНК-зондом. Так как каждый фрагмент включает оба конца гена, он гибридизуется с кДНК-зоидами, специфичными по отнощению как к 5 -, так и к З -концевым последовательностям. [c.252]

С использованием полинуклеотид-киназы осуществляют перенос от [у = = "Р] АТР к 5 -концу интактной молекулы ДНК фага X. Затем необходимо провести полное расщепление меченой ДНК рестриктазой Яш dlll. Рестрикщсонные фрагменты разделяют с помощью электрофореза и идентифицируют положение каждого из фрагментов после окрашивания геля в растворе бромистого этидия. После этого гель накладывают на рентгеновскую пленку для идентификации двух меченых концевых фрагментов с помощью радиоавтографии. [c.282]

Методы, используемые нами для синтеза равномерно меченных и меченных по концам одноцепочечных ДНК-зондов, очень похожи. Принцип их проиллюстрирован на рис. 10. Фрагмент ДНК, который предстоит исследовать, клонируется в репликативной форме бактериофага или в плазмидном векторе, продуцирующем одноцепочечные кольцевые молекулы только одной ориентации. Две наиболее распространенные системы такого типа — бактериофаг М13 и плазмиды, несущие точки начала репликации фага М13. Олигонуклеотидный праймер реассоциируют с одноцепочечной кольцевой молекулой так, чтобы он инициировал синтез ДНК на матрице тестируемой вставки в направлении от 5 - к З -концу. Для равномерно меченных зондов один из используемых при синтезе dNTP метится изотопами Р или в альфа-положении. Для зондов с концевой меткой олигонуклеотид метят по 5 -концу [y- PjATP, а для синтеза ДНК используют холодные dNTP. По окончании синтеза ДНК обрабатывается рестриктазой, расщепляющей кольцевую молекулу у конца вставки, противоположном сайту реассоциации с олигонуклеотидным праймером. В результате такой реакции получается линейный фрагмент ДНК, состоящий частично из двухцепочечного и частично из одноцепочечного участков. Денатурируя ДНК и проводя препаративный электрофорез в поли- [c.167]

Смотреть страницы где упоминается термин Концевое мечение фрагментов ДНК: [c.503] [c.506] [c.41] [c.195] [c.287] [c.217] [c.342] [c.174] [c.20] [c.507] [c.508] [c.20] [c.89] [c.86] [c.86] [c.359] [c.196] [c.99] [c.108] [c.251] [c.41] [c.137] [c.89] [c.314] [c.76] [c.297]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология