Полимеразная цепная реакция

Молекулярная биотехнология — это увлекательнейшая область научных исследований, с появлением которой произошел настоящий переворот во взаимоотношениях человека с живой природой. В ее основе лежит перенос единиц наследственности (генов) из одного организма в другой, осуш ествляемый методами генной инженерии (технология рекомбинантных ДНК). В большинстве случаев целью такого переноса является создание нового продукта или получение уже известного продукта в промышленных масштабах. В ч. I мы познакомим читателя с концепциями молекулярной биотехнологии и теми микроорганизмами, которые в ней используются, с основами молекулярной биологии и методологией рекомбинантных ДНК. Будут описаны такие методы, как химический синтез генов, полимеразная цепная реакция (ПЦР), определение нуклеотидной последовательности (секвенирование) ДНК. Помимо успешного клонирования нужного гена очень важно обеспечить его правильное функционирование в организме нового хозяина, поэтому мы остановимся также на способах оптимизации работы клонированных генов в про- и эукариотических системах. И наконец, мы рассмотрим, как можно улучшить свойства конечных продуктов, модифицируя клонированные гены путем введения в них специфических нуклеотидных замен (мутагенез in vitro). В целом материал, изложенный в первой части, служит фундаментом, который позволяет понять различные аспекты конкретных применений молекулярной биотехнологии. [c.13]

Рис. 5-89. Полимеразная цепная реакция (ПЦР), используемая для амплификации специфических нуклеотидных последовательностей in vitro А Выделенную из клеток ДНК нагревают, чтобы разделить ее комплементарные цепи. Затем проводят отжиг этих цепей, добавив к ним избыток двух ДНК-олигонуклеотидов (по 15-20 нуклеотидов каждый), синтезированных химически с таким расчетом, чтобы они были комплементарны последовательностям, отделенным друг от друга расстоянием в X нуклеотидов (значение X варьирует от 50 до 2000). Эти два олигонуклеотида служат специфическими затравками для синтеза ДНК in vitro, катализируемого ДНК-полимеразой, которая копирует ДНК между соответствующими последовательностями. Б. Многократное повторение циклов реакции дает в итоге большое количество копий одного фрагмента

Молекулярно-биологические методы диагностики позволяют обнаружить в образцах, взятых от больного, при вскрытии или из окружающей среды молекулы НК возбудителя. Их специфичность обусловлена индивидуальностью геномов — нуклеотидных последовательностей ДНК и РНК организмов и основана на принципе комплементарности — соответствии друг другу нуклеотидных пар (А-Т, Г-Ц), позволяющем гибридизоваться сходным фрагментам НК (в том числе эталонному и искомому фрагментам). Высокую чувствительность эти методы приобрели с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР). [c.93]

К числу наиболее важных для молекулярной биотехнологии методов, помимо клонирования генов, относятся методы химического синтеза ДНК, секвенирование ДНК и полимеразная цепная реакция (ПЦР). [c.102]

За четыре года, прошедших со времени выхода в свет первого издания книги Молекулярная биотехнология принципы и применение , в области биотехнологии было сделано огромное количество открытий. На рынке появилось множество новых генноинженерных продуктов (например, вакцин и лекарственных препаратов). Рутинной практикой клинических лабораторий стало использование иммунологических методов диагностики и методов, основанных на применении полимеразной цепной реакции. Открыты и охарактеризованы многие гены, ассоциированные с различными заболеваниями человека, неизмеримо возрос объем клинических испытаний в области генной терапии. Построены подробные генетические и физические карты хромосом человека впервые из дифференцированной соматической клетки клонировано жизнеспособное млекопитающее. Производство одного из трансгенных растений, сои, поставлено на коммерческую основу. [c.7]

Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием ПЦР-амплификации Более простой и быстрый метод получения больших количеств мутантных генов, альтернативный системе с использованием фага М13, -сайт-специфический мутагенез в сочетании с полимеразной цепной реакцией (ПЦР). Один из вариантов этого подхода состоит в следующем. Ген-мишень встраивают в плазмидный вектор (рис. 8.4) и помещают препарат в две пробирки. В каждую из них добавляют по два специфических праймера для ПЦР 1 и 2 в одну пробирку, 3 и 4 - в другую. Праймеры 2 и 3 полностью комплементарны одному из участков клонированного гена или прилегающей к нему последовательности, а 1 и 3 комплементарны другому участку, но содержат один некомплементарный нуклеотид и гибридизуются с разными цепями, так что в результате происходит замена обоих нуклеотидов данной пары. Положение сайтов гибридизации праймеров 1 и 2 в одной пробирке и 3 и 4 - в другой таково, что ПЦР-продукты в разных пробирках имеют разные концы. По окончании ПЦР содержимое пробирок объединяют и проводят денатурацию, а затем ренатура-цию. Поскольку концы амплифицированных молекул ДНК из двух пробирок неодинаковы, одноцепочечные ДНК из разных пробирок ассоциируют с образованием кольцевьгх молекул с [c.163]

Для идентификации трансгенных животных вьщеляют ДНК из маленького кусочка хвоста и тестируют ее на наличие трансгена с помощью блот-гибридизации по Саузерну методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Чтобы определить, находится ли трансген в клетках зародышевой линии животного, трансгенную мышь скрещивают с другой мышью. Далее можно проводить скрещивание потомков для получения чистых (гомозиготных) трансгенных линий. [c.421]

Часто встречающиеся типы полиморфизма у человека, которые можно типировать с помощью полимеразной цепной реакции [c.458]

Первым этапом анализа ДНК является экстракция ДНК из любой ткани, содержащей ядерные клетки с последующей ее очисткой. Далее геномную ДНК анализируют с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) или подвергают расщеплению ферментами рестрикции — рестриктаза-ми, распознающими специфические последовательности нуклеотидов и гидролизующими ДНК на ряд фрагментов рестрикции . Последние могут быть разделены методом электрофореза или подвергнуты денатурации нагреванием до однонитевых фрагментов, которые затем переносят на нейлоновый фильтр или нитроцеллюлозную мембрану. Таким образом сохраняется пространственное расположение фрагментов ДНК относительно друг друга. Полученный материал анализируется с помощью ДНК-зонда, представляющего собой фрагмент одноцепочечной ДНК, как правило, помеченный радиоактивным изотопом Р и содержащий специфическую последовательность оснований, комплементарную участку ДНК, который необходимо обнаружить. В качестве зонда можно использовать как нативную ДНК, специфичную гену (геномные зонды), так и синтетическую ДНК, полученную на основе РНК гена (комплементарная ДНК). Если анализируемая последовательность присутствует во фрагментах рестрикции, то зонд гибридизуется с ними, что можно обнаружить с помощью авторадиографии. [c.528]

Созданы и применяются в производстве высокочувствительные диагностические препараты на основе метода ИФА (иммуноферментного анализа), ДНК-зондов, внедрения полимеразной цепной реакции (ПЦР).Используются моноклональные антитела, полученные методом гибридомной технологии. Получены генетически трансформированные кролики с геном асРНК, устойчивые к вирусам лейкоза, а также трансгенные кролики с геном альфа-2 интерферона. Разработана рекомбинантная вакцина против лейкоза крупного рогатого скота на основе оспененного вектора. На культуре клеток нарабатывается антиген и производится диагностика лейкоза крупного рогатого скота. Генно-инженерные вакцины против ящура и сибирской язвы производятся в объемах, обеспечивающих потребности в них России, стран СНГ и ряда других государств мира. [c.428]

Создан метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) [c.18]

Полимеразная цепная реакция [c.94]

Использование специфических термостабильных ДНК-полиме-раз — Tth- и Taq-полимераз — выделенных из бактерий, живущих в гейзерах, позволило проводить амплификацию — множественную наработку любого фрагмента ДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Метод ПЦР, в основу которого положена Г(яд -полимераза, не только упростил некоторые старые методики генной инженерии, но и позволил проводить молекулярное маркирование как отдельных генов, так и целых геномов. [c.24]

Рис 71 Схема полимеразной цепной реакции ПЦР) I — в классическом исполнении (а — ДНК мишень б — праймер в ПЦР в — новая ДНК г — направление амплификации дс — денатурация и синтез) II — заякоренная ПЦР (1 — мРНК 2 [c.206]

Открытие метода полимеразной цепной реакции - получения новых молекул ДНК с помощью фермента ДНК-полнмеразы [c.777]

Выделение ДНК, синтез двухцепочечных ДНК, конструирование векторов, получение продуктов с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), способы очистки рекомбинантных белков [c.535]

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Рассмотренный выше анализ полиморфизма длины фрагментов рестрикции требует довольно большого количества ДНК, что реализуется с помощью полимеразной цепной реакции. ПЦР позволяет избирательно копировать интересующую последовательность нуклеотидов в ДНК эта методика позволяет исследовать эмбрион на носитель мутантного гена, поскольку единичную клетку можно извлечь из эмбриона без опасных последствий на очень ранней стадии [c.528]

Метод можно сделать еще более чувствительным, если увеличить количество ДНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Это означает, что профиль ДНК можно получить, используя минимальную по объему пробу ДНК (например, выбитый с помощью дырокола кусочек облизанной подозреваемым почтовой марки). Любой человек, оставивший частичку перхоти или чихнувший на месте преступления, может стать подозреваемым [c.266]

Визуальная идентификация зон лизиса — утомительная и субъективная процедура. Вместо нее для обнаружения рекомбинантных бакуловирусов можно использовать ДНК-гибридизацию или полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Кроме того, если под контроль промотора бакуловируса, активного с ранних и до поздних стадий литического цикла, поместить ген la Z Е. соН, кодирующий -галакгозидазу, и такую конструкцию включить во фрагмент ДНК, встраивающийся в геном A MNPV, то в присутствии хромогенного субстрата -галактозидазы зоны с рекомбинантными вирусами окрасятся в синий цвет. [c.144]

Во избежание избыточной нагрузки на защитные вещества карточки рекомендуется наносить пятно крови только на ее верхнюю поверхность и прекращать нанесение крови на какой-либо из участков карточки, как только на противоположной стороне этого участка ясно проявится пятно крови. Это простое правило нанесения крови имеет два следствия. Во-первых, защитные реагенты карточки остаются в достаточном избытке. Во-вторых, загружается примерно постоянное количество ДНК, что позволяет добиться воспроизводимости условий проведения полимеразной цепной реакции. [c.93]

Специфическая ферментативная амплификация ДНК in vitro полимеразная цепная реакция [c.89]

Специфичность ферментативных тестов можно значительно повысить, проводя анализ не общей ферментативной активности, а отдельных молекулярных форм или изоэнзимов. Для этого применяют такие методики, как электрофорез, ионообменную или гель-распределительную хроматографию, изоэлектри-ческое фокусирование. Еще одним методом анализа изоферментов может служить использование специфических к изоферменту антител. Этот метод обладает высокой чувствительностью и может быть легко автоматизирован. В последние годы получила распространение диагностика наследственных заболеваний при помощи рекомбинантньос ДНК и метода полимеразной цепной реакции. В этой технологии большую роль играют ферменты рестриктазы. [c.87]

Описаны методы трансфекции эукариотических клеток рестрикционное картирование технология больших молекул ДНК выявление единичных замен нуклеотидов в ДНК проведение полимеразной цепной реакции получения ДНК генная дактилоскопия. [c.4]

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - это эффективный способ получения in vitro большого числа копий специфических нуклеотидных последовательностей. Их амплификация - иногда в миллионы раз - осуществляется в ходе трехэтапного циклического процесса. Для ПЦР необходимы 1) два синтетических олигонуклеотидных праймера (длиной примерно по 20 нуклеотидов), комплементарные участкам ДНК из противоположных цепей, фланкирующим последовательность-мишень их 3 -гидроксильные концы после отжига с ДНК должны быть ориентированы навстречу друг другу 2) ДНК-мишень длиной от 100 до -35 ООО п. п. 3) термостабильная ДНК-по-лимераза, которая не теряет своей активности при температуре 95° и выше 4) четыре дезокси-рибонуклеотида. [c.94]

Технологический прогресс в любой области науки всегда стимулирует ее дальнейшее развитие. С появлением новых технологий появляется возможность ставить новые эксперименты и облегчается проведение старых. Становление молекулярной биотехнологии как науки обязано целому ряду технологических разработок многие из них ныне широко применяются как в крупных исследовательских центрах, так и небольших научных коллективах. Теперь не составляет особого труда химически синтезировать одну молекулу ДНК, определить нуклеотидную последовательность другой и амп-лифицировать с помощью полимеразной цепной реакции третью. Все это стало возможным благодаря той информации, которая была получена в ходе основополагающих исследований как самой ДНК, так и механизма ее репликации. Эти экспериментальные подходы стали неотъемлемой частью молекулярного клонирования - процедуры, позволяющей выделять из ДНК нужные фрагменты, охарак-теризовывать их и производить с ними разнообразные манипуляции. [c.80]

Полимеразная цепная реакция, ПЦР (Polymerase hain rea tion) Метод амплификации специфического сегмента ДНК с помощью термостабильной ДНК-поли-меразы с использованием олигонуклеотидных ДНК-зондов, комплементарных последовательностям противоположных цепей ДНК, фланкирующим амплифицируемый сегмент. Процесс состоит из серии циклически повторяющихся реакций денатурации ДНК, отжига зондов, синтеза ДНК. [c.557]

Необходимо подчеркнуть, что обязательным условием проведения полимеразной цепной реакции является знание нуклеотидной последовательности того или иного объекта исследования (вирус, бактерия и др.). В настоящее время в банках данных имеются практически полные сведения о геноме различных патогенньгх микробов. [c.93]

ПЛФ — пиридоксальфосфат ПЦР — полимеразная цепная реакция РНК — рибонуклеиновая кислота РНКаза — рибонуклеаза рРНК — рибосомная РНК СПИД — синдром приобретенного иммунодефицита Т — ТИМИН [c.13]

США Муллис К. Открытие метода полимеразной цепной реакции для получения новьк молекул ДНК с помощью фермента ДНК-полимеразы [c.543]

Доступность очищенных ДНК-полимераз и химически синтезированпых ДНК-олигоиуклеотидов сделала возможным быстрое клонирование специфических последовательностей ДНК вне живой клетки. Методика, известная под названием полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяет амплифицировать ДНК из какого-нибудь выбранного участка генома более чем в миллион раз, при условии, что нам известна хотя бы часть его нуклеотидной последовательности. Участки этой последовательности, окружающие выбранную для амплификации область, используют для того, чтобы приготовить по ним два синтетических ДНК-олигонуклеотида, каждый из которых комплементарен одной из двух цепей молекулы ДНК. Эти олигонуклеотиды служат затравками при синтезе ДНК in vitro катализируемом ДНК-полимеразой опи определяют концы получаемого фрагмента ДНК (рис. 5-89, AJ. [c.341]

И. Гыске Л.И., Иванов П.Л. Анализ полиморфизма длины амплификационных фрагментов ДНК в судебной идентификационной экспертизе возможные источники ошибок при неоптимальных условиях полимеразной цепной реакции // Судебно-медицинская экспертиза, 1995. — № 4. — С. 12-17. [c.14]

Отобранные сегменты ДНК можно клонировать in vitro посредством полимеразной цепной реакции 341 [c.513]

Молекулярная биотехнология принципы и применение (2002) -- [ c.0 ]

Биология Том3 Изд3 (2004) -- [ c.0 ]

Молекулярная биология клетки Т.3 Изд.2 (1994) -- [ c.341 ]

Искусственные генетические системы Т.1 (2004) -- [ c.192 , c.193 , c.194 , c.195 , c.196 , c.197 , c.198 , c.199 , c.200 , c.201 , c.202 , c.203 , c.204 , c.205 , c.206 , c.207 , c.208 , c.209 , c.210 , c.211 , c.212 , c.213 , c.214 , c.215 , c.216 , c.217 , c.218 , c.219 , c.220 , c.221 , c.222 , c.223 , c.224 , c.225 , c.226 , c.227 , c.228 , c.229 , c.230 , c.231 , c.232 , c.233 , c.234 , c.235 , c.236 , c.237 , c.238 , c.239 , c.240 , c.241 ]

Что если Ламарк не прав Иммуногенетика и эволюция (2002) -- [ c.0 ]

Генетическая инженерия (2004) -- [ c.48 , c.49 ]

Молекулярная биология клетки Т.3 Изд.2 (1994) -- [ c.341 ]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология