Фрагмент Кленова

ДНК-полимераза I состоит из одного полипептида длиной 911 аминокислотных остатков (а. а.) (Air=102 000 D). Этот фермент отличается от прочих ДНК-полимераз Е. соИ наличием З -экзонуклеазной активности. Фактически ДНК-полимераза I — это два фермента на одной полипептидной цепи ограниченный протеолиз расщепляет эту ДНК-полимеразу на большой и малый фрагменты с разными активностями. Большой субфрагмент ДНК-полимеразы I (называемый также ДНК-полимеразой Кленова или фрагментом Кленова) обладает полимеризующей и З -экзонуклеазной (корректирующей) активностями. Малый субфрагмент несет З -экзонуклеазную активность, 5 -экзонуклеаза ДНК-полимеразы I действует на 5 -конец полинуклеотидной цепи только в составе дуплекса и отщепляет от него как моно-, так и олигонуклеотиды. Направление действия 5 -экзонуклеазы совпадает с направлением полимеризации новой цепи ДНК, т. е. в ходе полимеризации экзонуклеаза расчищает дорогу для полимеразы (рис. 29). Подобные свойства ДНК-полимеразы I соответствуют ее функциям в клетке эта полимераза удаляет различного рода дефекты из ДНК в ходе репарации и служит вспомогательной поли- [c.48]

Фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I 1 ед./мкл, кат. № 27-0928-01). [c.299]

Фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I 0,6 мкл. [c.300]

Б. Введение концевой метки в ДНК с помощью фрагмента Кленова [c.16]

Добавьте вторую рестриктазу в количестве, необходимом для полного гидролиза ДНК. Фрагмент Кленова можно не инактивировать. [c.17]

Рис. 4.12. Получение меченого ДНК-зонда методом случайных праймеров. К денатурированной двухцепочечной ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, которую предполагается использовать в качестве зонда, добавляют гексануклеотиды (смесь всех возможных комбинаций из шести нуклеотидов) и отжигают смесь. Некоторые из олигонуклеотидов гибридизуются с немеченой денатурированной ДНК, и в присутствии фрагмента Кленова и четырех с1НТР (один из которых меченый [ ]) служат затравкой для синтеза комплементарной цепи. После денатурации синтезированной ДНК получают смесь меченых фрагментов ДНК, которые вместе составляют практически полноразмерную исходную ДНК-матрицу.

Рис. 8.1. Олигонуклеотид-направленный мутагенез. Одноцепочечную ДНК фага М13 (плюс-цепь), несущую ген-мишень, отжигают с комплементарным синтетическим олигонуклеотидом, содержащим одно основание, не комплементарное соответствующему основанию исходной ДНК. Олигонуклеотид служит затравкой для синтеза ДНК, а М13-вектор с встроенным геном — матрицей. Репликацию катализирует фрагмент Кленова ДНК-полимеразы 1 Е. oli. Синтезированную полноразмерную цепь замыкает в кольцо ДНК-лигаза Т4. Образовавшимися двухцепочечными молекулами трансформируют Е. соИ. Часть фаговых частиц содержит ДНК дикого типа, часть — мутантную ДНК.

Рис. 8.7. Внесение случайных мутаций в клонированный ген. Вектор, несущий клонированный ген, расщепляют рестриктазами RE1 и RE2, в результате чего образуются один 3 - и один 5 -укороченные концы (и соответственно один 3 - и один 5 -выступающие концы). Затем его обрабатывают ферментом ЕхоТП, который расщепляет ДНК только с укороченного 3 -конца, удаляя по одному нуклеотиду. Через некоторое время реакцию останавливают и заполняют образовавщийся пробел с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I Е. соИ. При этом в реакционную смесь добавляют все четыре дезоксинуклео-зидтрифосфата (dNTP) и в небольшом количестве -аналог одного из них. Обрабатывают продукт нуклеазой S1 для образования тупых концов, лигируют с помощью ДНК-лигазы Т4 и трансформируют клетки

Для мечения эндонуклеазных фрагментов существуют и другие способы. Усеченный З -конец фрагмента можно удлинить (достроить) при помощи фрагмента Кленова, использующего выступающий 5 -конец в качестве матрицы достраивание осуществляется за счет добавленных в реакционную смесь дезоксирибонуклеотидов, один из которых несет метку. Кроме того, к вы- [c.463]

Фрагмент Кленова (Klenov fragment) Более крупный из двух фрагментов ДНК-полимеразы I Е.соИ, образующийся при ее протеолитическом расщеплении. Сохраняет полимеразную активность в направлении 5 —>3 и экзонуклеазную — в направлении 3 ->5. Используется, в частности, при секвенировании ДНК, [c.563]

В своем оригинальном варианте метод заключается в использовании исследуемой ДНК в качестве матрищл для ДНК-полимеразы I из Е.соИ, или, точнее, так называемого фрагмента Кленова, который получают из ДНК-полимеразы I после протеолитического отщепления домена, ответственного за 5 — [c.281]

Как уже упоминалось, чаще всего в качестве матрицы для анализа используются фрагменты ДНК, клонированные в одноцепочечных фагах. Для унификации анализа последовательности любых фрагментов, клонированных в составе данного фага-вектора, можно использовать одну и ту же затравку. Для этого затравка должна быть комплементврна ие клонированному фрагменту, а (- -)-цепи фага вектора в том ее месте, которое граничит с З -концом клонированной вставки (рис. 185). В качестве затравок чаще всего используются синтетические олиго- и дезоксирибонуклеотиды. Для исключения деградации затравки с 5 -конца в качестве ДНК-полимеразы применяется обычно фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I Е. oli. [c.328]

При мягком протеолитическом расщеплении субтилизином ДНК-полимераза 1 дает два полипептида, один из которых обладает только 5 З -зкзонуклеазной активностью, тогда как другой сохраняет полимеразную и 3 5 -экзонуклеазную активности. Последний фрагмент носит названне большого фрагмента ДНК-по-лимеразы 1 или фрагмент Кленова. [c.350]

ДНК-полимераза I (но не фрагмент Кленова) широко используется для получения меченых ДНК методом так называемой /шк-трансляции (от англ. ni k, обозначающего одноцепочечный разрыве). Если одна нз цепей ДНК содержит одноцепочечный разрыв так, что З -концевой нуклеотид в месте разрыва имеет З -ОН-группу, то ДНК-полимераза 1 в присутствии четырех нук-леозидтрифосфатов осуществляет матричный синтез. Одновременно она гидролизует существовавшую цепь за счет 5 З -экзоиук-леазной активности, как показано на схеме [c.350]

Проведите расщепление 1—5 мкг гетерологичной ДНК подходящей рестриктазой и выделите нужный фрагмент методом электрофореза в агарозном геле. Если необходимо использовать ДНК-линкеры, после расщепления рестриктазой затупите концы ДНК. Тупые концы формируют путем достраивания укороченных З -концов фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I или удаления выступающих З -концов под действием 3 -5 -эндонук-леазной активности ДНК-полимеразы Т4 [14]. После пришивания линкеров к фрагменту с тупыми концами [14] надо получить липкие концы путем расщепления линкерной ДНК с помощью подходящей рестриктазы. [c.144]

Добавьте к снеси по 4 мкл 2,5 растворов остальных немеченных дХТФ, комплементарных основаниям в выступающем конце.Добавьте 1-5 ел фрагмента Кленова. [c.17]

К-фосфатном буфере (pH 7) с I мМ р-меркаптоэтанола и 50% глицерина при —20°. Для некоторых целей используется и продается отдельно фрагмент ДНК-полимеразы I с AI 76 ООО. Этот фрагмент обладает полимеразной активностью, но лишен экзо-нуклеазной. Его иногда называют фрагментом Кленова . [c.260]

N-концевой домен молекулы ДНК-полиме-разы IЕ. соН соединен со след)тощим доменом петлей из аминокислотных остатков (см. рис. 1.12), которая наиболее доступна действию протеаз. Поэтому при ограниченном протеоли-зе фермента субтилизином, трипсином или другими протеазами он распадается на два фрагмента, имеющих размер 68 кДа и 35 кДа. Меньший фрагмент обладает 5 -3 -экзонуклеазной активностью, а больший — 5 -3 -полимеразной и 3 -5 -экзонуклеазной активностями. Последний бифункциональный фрагмент принято называть фрагментам Кленова ДНК-полимера-зы IЕ. oli (по фамилии одного из описавших его авторов). Фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I (PolIK) можно выделить также из экстрактов Е. соИ. Происходит ли образование этого фрагмента в клетке или он формируется в процессе экстракции, пока не ясно. [c.25]

Рассмотренные свойства фрагмента Кленова ДНК-полимеразы IЕ. соН позволили Д. Гоед-делу с соавторами предложить в 1980 г метод репарации, направляемой праймером (primer ге- [c.25]

По окончании синтеза первая и вторая цепи кДНК остаются ковалентно связанными петлей шпильки, служившей праймером при синтезе второй цепи. Эту петлю расщепляют эндонуклеазой S1, специфически разрушающей одноцепочечные участки нуклеиновых кислот. Образующиеся при этом концы не всегда оказываются тупыми, и для повышения эффективности последующего клонирования их репари-руют до тупых с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы IЕ. соИ. Полученную двухцепочечную кДНК можно затем встраивать в клонирующие векторы, размножать в составе гибридных молекул ДНК и использовать для дальнейших исследований. [c.27]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология