Агарозный гель, очистка фрагментов

Б, Выделение из агарозного геля и очистка фрагментов ДНК [c.345]

Клонированные фрагменты ДНК отделяют от вектора с помощью рестриктазной обработки и последующего препаративного электрофореза в агарозном геле. Препараты ДНК, предназначенные для микроинъекции, не должны содержать каких-либо вредных примесей, токсичных для яйцеклетки, а также твердых частиц, которые могут закупорить просвет микроиглы. Адекватный метод очистки ДНК описан в табл. 10.10. [c.343]

Электрофоретическое и хроматографическое разделение нуклеиновых кислот. Для дополнительной очистки плазмидной ДНК иногда применяют гель-фильтрацию на Сефакриле S1000 (крупнопористый синтетический аналог сефадекса) [66], а также электрофорез в агарозном геле. Следует отметить, что электрофорез в агарозном, полиакриламидном или смешанном агарознополиакриламидном гелях используют для определения размеров и выделения небольших фрагментов дцДНК, образующихся при [c.41]

Высокомолекулярный шмир на фоне дискретных продуктов ПЦР или при полном их отсутствии. Шмир очень часто возникает при использовании плохо очищенных матриц. При появлении шмира светится вся дорожка в агарозном геле после проведения электрофореза и окрашивания его бромистым этидием. В этом случае имеют место множественные неспецифические инициации синтеза ДНК из-за присутствия в реакционной смеси низкомолекулярных затравок в виде неспецифических фрагментов ДНК или РНК, а также повторяющихся последовательностей в матрице, которые залипают друг на друга. Денатурированные белки, неспецифически удерживая концы фрагментов ДНК вблизи матрицы, могут создавать места множественной инициации синтеза ДНК и т.п. Имеются, по крайней мере, две возможности преодоления такого эффекта дополнительная очистка матрицы, например, с помощью фенольной депротеинизации или с использованием ионообменной смолы СЬе1ех-100 [270], а также, если по каким-то причинам хорошо очищенные матрицы недоступны, применение модифицированных ДНК-полимераз в ПЦР с горячим стартом (см. ниже). [c.206]

Недавно разработанные системы направленного мутагенеза с использованием ПЦР и мегапраймеров позволяют существенно облегчить процесс получения мутаций, что достигается отказом от использования перекрывающихся мутантных праймеров для синтеза мутантных фрагментов ДНК [25, 26]. Принцип этого метода заключается в следующем (рис. 36,а). В первом раунде ПЦР синтезируют мутантный фрагмент ДНК, в который вводят мутации с помощью одного из праймеров (праймер М). Поскольку образующийся продукт ПЦР обладает значительными размерами (его допустимые размеры 70-800 п.о.) и используется в качестве праймера в следующем раунде ПЦР, он получил название мегапраймера. Фрагмент очищают электрофорезом в агарозном геле и используют в качестве праймера во втором раунде репликации со встречным праймером А. Праймеры А и В могут быть универсальными и содержат на своих 5 -концах сайты рестрикции для дальнейшего клонирования фрагмента. Конечный продукт ПЦР, образовавшийся после второго раунда амплификации, длина которого может быть в пределах 400-2500 и.о., после очистки и инкубации с соответствующими рестриктазами клонируют в подготовленном векторе, заменяя исходный фрагмент ДНК на мутантный, полученный с использованием мегапраймера. [c.298]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология