также Гель-электрофорез

В сыворотке крови здорового человека при электрофорезе на бумаге можно обнаружить 5 фракций альбумины, О -, а,-, 3-, у-глобулины. Методом электрофореза в агаровом геле в сыворотке крови выделяют 7— 8 фракций, а при электрофорезе в крахмальном или полиакриламидном геле—до 16—17 фракций. Следует помнить, что терминология белковых фракций, получаемых при различных видах электрофореза, еще окончательно не установилась. При изменении условий электрофореза, а также при электрофорезе в различных средах (например, в крахмальном или полиакриламидном геле) скорость миграции и, следовательно, порядок белковых зон могут меняться. [c.569]

ДНК-зонды применяют для поиска родственных генов в реакциях гибридизацрш с РНК — для выявления экспрессии данного гена в различных клетках. Для вьывления молекул нуклеиновых кислот, комплементарных всему зонду (или его участку), ДНК-зонды часто сочетают с методом гель-электрофореза, что позволяет получать информацию о размерах гибридизируемых молекул ДНК. Эффективное использование современных приборов, способных автоматически синтезировать любые нуклеотидные последовательности за короткий промежуток времени, дало возможность перестраивать гены, что представляет собой один из важных аспектов генной инженерии. Обмен генами, а также введение в клетку гена другого вида организма осуществляют посредством генетической рекомбинации in vitro. Этот подход был разработан на бактериях, в частности на Е. соИ. Он основан на важном свойстве ДНК — способности к перестройкам, изменяющим комбинацию генов в геноме и их экспрессию. Такая уникальная способность ДНК позволяет приспосабливаться данному виду к изменяющейся среде. Генетическую рекомбинацию подразделяют на два больших класса общую рекомбинацию и сайт-специфическую рекомбинацию. В процессе общей рекомбинации генетический обмен в ДНК происходит между гомологичными нуклеотидными последовательностями, например между двумя копиями одной и той же хромосомы в процессе мейоза (кроссинговера), или при скрещивании и перегруппировке генов у бактерий. [c.112]

Электрофорез использовали в основном для подтверждения однородности фракций выделенных полисахаридов, а также в экспериментах по фракционированию в щелочном растворе полиоз из еловой холоцеллюлозы [67]. Этот метод, а также гель-проникающая хроматография на полиакриламиде не обеспечили успеха при фракционировании. Гель-проникающая хроматография на декстрановых гелях дала хорошие результаты при разделении смесей полиоз, [c.35]

Абсолютный размер молекул ДНК генома накладывает определенные ограничения на хроматографические и электрофоретические методы, которые могут быть использованы для разделения этих соединений. Даже вирусные ДНК во много раз длиннее встречающихся в природе РНК. Хромосомы большинства бактерий состоят из единственной молекулы ДНК с молекулярной массой около 3-10 (10 пар оснований), а молекулярная масса содержащейся в клетках животных ядерной ДНК еще на три порядка больше (молекула состоит из 10 пар оснований). В силу очень высокого отрицательного заряда и значительных по величине неионных взаимодействий высокомолекулярных ДНК с сорбентом разделение этих соединений с помощью анионообменной хроматографии практически невозможно. В случае гель-электрофореза также приходится сталкивать- [c.183]

При падении напряжения в процессе электрофореза выделяется тепло, пропорциональное силе тока. Избыточное тепло приводит к образованию неровных полос. Если в начале электрофореза температура системы была 20 °С, то через 40 мин она повышается до 30—40°С. Температуру можно снизить, уменьшив силу тока, например, до 1 мА/гель при большей продолжительности электрофореза (140 мин). Однако в этом случае происходит некоторое расширение полос за счет диффузии. Можно также проводить электрофорез при 4°С, даже перемешивая при этом нижний электродный буфер. [c.264]

Белки мочи анализируют практически теми же методами, что и белки сыворотки. Описанные выше основные типы распределения белков можно различить с помощью любого электрофоретического метода, дающего достаточное разрешение белков плазмы, например с помощью электрофореза в агарозном геле или на ацетате целлюлозы. Можно также применять электрофорез в полиакриламидном геле в буфере с ДСН, так как при клубочковой протеинурии в моче преобладают белки со значительно более высокой молекулярной массой, чем при канальцевой протеинурии [1149]. [c.364]

Молекулярную массу белков можно также определять посредством гель-электрофореза в полиакриламиде [41]. Мономеры, предназначенные для образования геля, растворяют в буфере и полимеризуют в стеклянных трубках или между пластинками при использовании в качестве сшивающего агента бисакриламида. Большая разделяющая способность метода объясняется молекулярно-ситовым эффектом. [c.361]

Заряженные частицы перемещаются в растворе под влиянием электрического поля с различной скоростью. Уже в первой половине нашего столетия для этого явления было введено понятие "электрофорез" или "электрический перенос". Различие скоростей перемещения может быть обусловлено двумя причинами (а) различные молекулы несут на себе различные заряды и поэтому при наложении электрического поля могут ускоряться в различной степени (б) их перемещению препятствует различающееся по величине сопротивление трения. В простейшем случае разделительная среда (раствор электролита) находится в трубке. Из-за отвода Джоулева тепла на практике зачастую наблюдается искажение зон за счет различных плотностей электролита и конвекционных потоков. В случае классического электрофореза применяются гели или полоски бумаги, пропитанные электролитами для того, чтобы уменьшить помехи, вызванные конвекцией, а также чтобы увеличить сопротивление трения макро-молекул с незначительными различиями в зарядах и тем самым усилить эффект разделения. Использование полиакриламидного гель-электрофореза (ПААГ-электрофореза) позволяет проводить эффективное разделение молекул ДНК и белков. Благодаря изменению степени сшивания геля может быть оптимизирована производительность разделения. При использовании гель-электрофореза белков, денатурированных додецилсульфатом натрия (ДДСН), возможно непосредственное определение их молекулярной массы. Разделение в этом случае основано исключительно на затруднении миграции пробы через гель (без геля все денатурированные додецилсульфатом натрия белки перемещаются с одинаковой скоростью). [c.5]

Наряду с КЗЭ, при котором удается осуществить разделение только за счет разницы в подвижности, и который в настоящее время представляет собой наиболее распространенный метод, выделяют также капиллярный гель электрофорез (КГЭ) с капилляром, заполненным гелем. При этом на электрофоретическую миграцию молекул оказывает влияние матрица геля, и поэтому достигается селективное разделение молекул по размерам. Незаряженные молекулы можно разделять с помощью мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ). В данном случае к буферу добавляется детергент, и нейтральные молекулы распределяются между буфером и мицеллами в соответствии с их гидрофобностью. Разделение основано на подвижности мицелл, заряженных в большинстве случаев отрицательно. Поскольку в основе разделения лежит процесс распределения, можно с полным основанием говорить о хроматографическом методе. При изоэлектрической фокусировке (ИЭФ) происходит разделение в градиенте pH, формируемом добавлением амфолита к буферу в электрическом поле. Небольшое распространение получила пока электрохроматография (ЭХ), при которой применяется стационарная среда ВЭЖХ, а течение эдюента и перенос пробы происходит только за счет электроосмотического потока. В качестве самой старой капиллярной техники следует упомянуть изотахофорез (ИТФ), который в настоящее время вновь приобрел значение для концентрирования проб в КЭ. [c.7]

Между тем все выделенные фракции невосстановленных белков имеют сложный состав. Фракционирование единиц глютенинов после восстановления дисульфидных связей алкилирования позволяет отделить более простые фракции. Для этого в основном применяют методы электрофореза ДДС-Na-nAAF, электрофокусирование, ДДС-Na-nAAr совместно с электрофокусировкой [20, 92, 108], но с определенным успехом использовали также гель-фильтрацию и ионообменную хроматографию. [c.200]

Хюбнер и др. [98] разделяли глютенины после восстановления и алкилирования (Я -глютенины) гель-фильтрацией на сефадексе G 200 (0,03М уксусная кислота, 4М мочевина) на три фракции (А, В, С) равной величины, из которых первая (А) обнаружена в агрегированной форме. Две неагрегированные фракции (В, С) были повторно фракционированы ионообменной хроматографией на сульфоэтилцеллюлозе. В таких условиях фракция В разделяется на 7 фракций, из которых некоторые, хотя состоят из нескольких субъединиц с разными молекулярными массами, при электрофорезе в кислом pH ведут себя как гомогенные. Аналогичные результаты получены [89] при фракционировании на сефадексе G 100. Данно и др. [58] добивались аналогичного разделения путем. избирательного осаждения субъединиц этанолом. Для фракционирования субъединиц глютенинов используются также гель-фильтрация и ионообменная хроматография после избирательного растворения в уксусной кислоте [127]. [c.200]

Двумерный электрофорез в полиакриламидном геле может быть также использован для локализации участков ДНК, отвечающих 5 - и З -концевым последовательностям и точкам внут-)имолекулярного переплетения ядерной или вирусной РНК 116]. С этой целью продукт гибридизации РНК и ДНК обрабатывают эндонуклеазой S1, специфичной по отношению к одноцепочечным нуклеиновым кислотам, и полученные гибриды комплементарных фрагментов ДНК и РНК разделяют в соответствии с их размерами с помощью гель-электрофореза. Затем в денатурирующих условиях проводят электрофорез во втором направлении, с тем чтобы определить размер образующихся одноцепочечных фрагментов ДНК. Специфические последовательности обнаруживают с помощью блоттинга по Саузерну и последующей молекулярной гибридизации [116]. Одноцепочечные фрагменты ДНК можно легко разделить с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в щелочной среде. Денатурированные образцы подвергают гель-электрофорезу в буфере, содержащем 30 мМ NaOH и 2 мМ ЭДТА [117]. По своему поведению в этих условиях электрофореза такие фрагменты похожи на одноцепочечные фрагменты РНК (разд. 10.5.2). [c.187]

В связи с изучением механизма биосинтеза пуромицина было исследовано ферментативное метилирование 0-деметилпуро-мицина [86]. Это соединение было синтезировано и очищено на колонке с силикагелем. Полученный из предшественника пуро-мицин выделяли ТСХ на целлюлозе и идентифицировали ТСХ и электрофорезом на бумаге. Для очистки пуромицина использовали также гель-фильтрацию на биогеле Р-2 в 0,01 М растворе карбоната аммония, содержащем 0,05% додецилсульфата натрия [87]. [c.226]

Борковский и др. [94] разделяли основания ДНК, аденин, гуанин, цитидин и тимин методом электрофореза на слоях агарового геля, используя 0,1 М буферный раствор ацетата натрия и уксусной кислоты (pH 3,7). Электрофорез, проводили в течение 45 мин при напряженности поля 5—7 В/см. Образец получали в результате 60-минутного гидролиза ДНК 72 %-ной хлорной кислотой, а после гидролиза выпаривали хлорную кислоту, освобождая основные соли. Цанев и др. [95] изучали влияние концентрации РНК, величины pH, температуры, состава буферного раствора и концентрации геля на фракционирование и подвижность РНК при электрофорезе на слоях геля. Для электрофоретического разделения АМР, ADP, АТР [96] и смесей аденина, аденозина, адениловой кислоты и ди- и трифосфатаденозинов [97] применяли также гель агарозы. [c.136]

Гемоглобин — сопряженные белки, содержащие глобины и гем (пигмент), состоящий из протопорфирина и двухвалентного железа), анализировали на слоях оксида алюминия и диэтиламиноэтилцеллюлозы, а также посредством электрофореза на геле крахмала [151—153]. Довольно широко применялся для разделения гемоглобинов тонкослойный электрофорез на агаре 154—157] и на крахмале [151, 158—163]. Шредер и Нельсон 164] применяли для хроматографии гемоглобинов ионообменные слои карбоксиметилцеллюлозы СМ-52 (Whatman). [c.280]

Эта довольно простая картина осложняется неоднородностью в содержании как белка, так и железа. Содержащиеся в небольших количествах компоненты, обнаруживаемые при ультрацентрифугировании [22, 23, 25] и при гель-электрофорезе [51- 3], были идентифицированы как мономер, димер, тример и т. д., причем содержание мономера составляло 80—90% от массы всего препарата [22, 23, 41, 49]. Биологическое значение этого полимера не выяснено. Неоднородность ферритина и апоферритина наблюдали также посредством изоэлектрического фокусирования [54, 55]. По-видимому, она не связана с содержанием железа или полимера, а, возможно, обусловлена изменениями в ацетильной, амидной, ионизированной карбоксильной или других присоединенных группах или ионах. Средняя изоэлектрическая точка ферритина лошади 4,4. Кроме того, недавно было показано, что ферри-тины из различных органов одного и того же животного имеют [c.304]

Для фракционирования олигорибонуклеотидов может быть также использован двумерный гель-электрофорез [127]. В ходе первой стадии электрофореза, которую проводят в 0,025 М лимонной кислоте, содержащей 6 М мочевину, происходит разделение олигомеров в соответствии с их размерами и нуклеотидным составом, а вторая стадия представляет собой обычный электрофорез при pH 8 [127].С помощью этого метода можно разделить олигомеры длиной до 80 нуклеотидных остатков. Путем сравнения картин распределения пятен ( отпечатков пальцев ), отвечающих разделенным с помощью двумерного электрофореза [и (или) гомохроматографии] олигорибонуклеотидам двух РНК, нуклеотидная последовательность одной из которых известна, можно оценить степень структурной гомологии этих РНК, а затем отобрать для дальнейшего анализа лишь такие олигорибонуклеотиды второй РНК, которые по подвижности не совпада-чют ни с одним из фрагментов РНК с известной структурой (рис. 10.11). [c.190]

Обычно электрофорез осуществляют в горизонтальных или вертикальных приборах различной конструкции, основной частью которых является лоток или камера с опорной средой. Электрофорез в геле можно проводить на колонках. При этом существенное отличие от предыдущих методов заключается в том, что цосле деления каждая зона может быть нослодоватольно элюирована с колоыки. Для аналитических целей применяют также дисковый электрофорез в полиакриламидном голе. [c.20]

Это свойство оказывается очень полезным, поскольку позволяет выделять предшественники тРНК в такой форме, когда единственное отличие их нуклеотидной последовательности от последовательностей зрелых тРНК состоит в наличии интронов. (У предшественников могут также отсутствовать и некоторые модифицированные основания.) Затем такие молекулы используются в качестве субстратов в бесклеточной системе, полученной из клеток дикого типа. За сплайсингом предшественника можно легко проследить очень просто - определяя степень уменьшения размеров образовавшегося продукта. Об этом уменьшении свидетельствует изменение положения полосы РНК при гель-электрофорезе, как показано на рис. 26.2. Такое уменьшение размеров, по-видимому, объясняется появлением полосы, соответствующей интрону. [c.318]

Паркер и сотр. [72] в предварительных опытах показали, что восстановление и алкилирование дисульфидных связей в трансферрине по методу Крестфилда и сотр. [73] не вызывают диссоциации трансферрина на субъединицы. Это было доказано с помощью ультрацентрифугирования, методом седиментационного равновесия, с помощью гель-фильтрации на сефадексе Г-75, а также методом электрофореза на крахмальном геле в различных буферных системах (формиатный буфер pH 2,8, фосфатно-цитратный буфер pH 5,6 и боратный буфер pH 9,0) в присутствии мочевины. Кроме того, при определении N-концевых аминокислот в трансферрине динитрофениль-ным методом Сэнджера [74] и цианатным методом Старка и Смита [75] был обнаружен только один остаток валина при расчете на молекулярный вес 83 ООО, что согласуется с ранее опубликованной величиной молекулярного веса [76, 76а]. На основании описанных данных молекулу трансферрина можно представить в виде одной полипептидной цепи, содержащей примерно 750 аминокислот, и, следовательно, трансферрин является самым крупным из белков плазмы, который не был диссоциирован на субъединицы. [c.128]

Для электрофореза в полиакриламидном геле используются разнообразные выпускаемые промышленностью и самодельные приборы. Мы предпочитаем те приборы, которые позволяют проводить разделение в тонких пластинах геля, что обеспечивает оптимальное разрешение. Лучшее разрешение на пластинах обусловлено тем, что возникающее во время электрофореза тепло здесь легко рассеивается, а также тем, что гель после электрофореза можно быстро фиксировать. Последнее важно для того, чтобы свести к минимуму диффузию белка в полосах. Пластины позволяют одновременно сравнивать много проб, и их легко сохранять после высушивания на листах фильтровальной бумаги. Радиоактивность в пробах выявляют радиоавтографией и фотофлюорографией, а высушенные на фильтровальной бумаге гели можно легко нарезать ножницами или резаком и после повторного насыщения водой вырезанных сухих полосок просчитывать на сцинтилляционном счетчике. Если не требуется большая разгонка в геле, электрофорез, фиксацию, окраску и высушивание успевают проводить за один день. [c.156]

Для гель-электрофореза в присутствии ДСН имеется большой набор буферных систем. Лучшее разрешение дают концентрированные буферные системы, у которых верхний (электродный) буфер содержит ионы, обладающие большой подвижностью и движущиеся через гель в виде передней зоны, или фронта. К моменту вхождения в разделяющий гель белки сжимаются этим движущимся фронтом в узкую полосу, а войдя в него, задерживаются за счет того, что гель обладает свойствами сита . Описанная ниже система представляет собой модификацию концентрирующей буферной системы, предложенной Лэмли [5]. См. также разд. 26.5.1. [c.156]

Эта глава включает материал по основным физикоаналитическим методам и процедурам разделения фотометрии, ионселективным электродам, хроматографии, измерению радиоактивности, гель-электрофорезу и ма-нометрии. Их использование в бактериологии во многих случаях сыграло важную роль и стало почти характерной чертой этой области науки. В настоящем руководстве приводится общее описание как достоинств, так и слабых сторон методов, специальных методик, прописей, а также примеров их применения в исследованиях бактерий. [c.167]

Диск-электрофорез в его многочисленных вариантах, позволяющий проводить разделение макромолекул, стал в астоящее время очень важным методом, применяемым в биологических и медицинских исследованиях, а также в клинической диагностике и промышленности (для контроля за технологическими процессами). С тех пор как в 1959 г. Орнстейн [67] и Дэвис [64] впервые описали метод прерывистого электрофореза, проводится широкое изучение всех аспектов гель-электрофореза, в результате чего был внесен большой вклад в разработку теории этого метода, получена подробная информация [c.258]

Поскольку скорость перемещеиия заряженных белков в электрическом поле зависит от фактической вязкости раствора, их движение будет ускоряться при восходящем и замедляться при нисходящем электрофорезе [1214]. Это необходимо учитывать при планировании экопери ментов. Например, если относительные электрофоретические подвижности разделяемых компонентов при данном pH относятся как 1 4 5, то восходящий электрофорез даст лучшие результаты. Для смеси белков с отношением относительных подвиж1ностей 1 2 3 4 разделение будет плохим как при восходящем, так и при нисходящем электрофорезе. В этом случае подвижности следует увеличивать или путем применения соли, создавая тем самым градиент электропроводности, или с помощью градиента pH (изоэлектрическое фокусирование). Можно также проводить электрофорез в среде, действующей как молекулярное сито (гели), чтобы фракционировать вещества не только по заряду, но и по размерам молекул. [c.28]

Для двухмерного разделения веществ применяли также аналитический электрофорез в тонких слоях геля сверхтонкого се-фадекса в сочетании с гельфильтрацией [513]. [c.50]

Если б с-акриламид заменить М.ы -диаллилтартардиамидом) в той же молярной концентрации, то образовавшийся полиакриламидный гель будет легко растворяться в 2%-ной йодной кислоте при комнатной температуре (20—30 мин) или при 37 °С (10 мин) [40]. После проведения в таком геле электрофореза( с применением щелочного буфера его сначала нейтрализуют уксусной кислотой и лишь после этого погружают в йодную кислоту. Его радиоактивность лучше всего определять в 0,37о-ном растворе ДФО в ксилоле, содержащем 25% (объем/объем) тритона Х-114 [38]. При желании в него можно также добавить. ДФОБ до конечной концентрации 0,2 г/л. Приведенная методи ка обеспечивает получение эффективности счета, равной 47%,, для Ш и 93% для С. [c.211]

Молекулярную массу белков определяют также при электрофорезе в градиентах полиакриламидного геля, содержащего ДСН [34, 146]. Гейнер [419] применил микроэлектрофорез в полиакриламидном геле с ДСН для изучения биосинтеза белков в отдельных нейронах. [c.225]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология