Формамид в градиенте сахарозы

Во втором варианте авторы использовали более широкий (и крутой) интервал концентраций сахарозы (5—25%) и растворяли ее в буфере на основе 70%-ного раствора деионизированного формамида ( денатурирующий градиент ). При тех же значениях частоты вращения ротора и температуры центрифугирование пришлось вести 54 ч (вместо 22 ч). Поли (А)-РНК оказалась в середине пробирки, зат оба маркера (5S и 18S РНК) хорошо видны на градиенте. Использование формамида для полного разворачивания всех молекул РНК (полной денатурации) повышает точность определения s o.a с помощью маркерных РНК, однако за это приходится расплачиваться чуть ли не трехкратным увеличением продолжительности центрифугирования ввиду значительного увеличения плотности и вязкости среды. [c.236]

Чистый формамид при 20° имеет вязкость (т)) 3,76 сП и плотность (р) 1,334 г/см . В первом приближении можно считать, что эти значения для водных растворов формамида изменяются, (от т = 1 и р=1 для воды) пропорционально его концентрации. Для 70%-ного раствора формамида в воде можно ориентировочно считать т)=2,92 сП, а р= 1,234 г/см . Если сопоставить эти значения с табличными данными для водных растворов сахарозы, можно видеть, что такую же вязкость имеет 29%-ный раствор сахарозы, а плотность — д аже 50%-ный раствор. Между тем в данном случае вязкость и плотность раствора формамида накладываются на аналогичные параметры раствора сахарозы. Этот градиент по-прежнему необходим для предотвращения конвекции и замедления оседания тяжелых частиц. Данные для более точной характеристики растворов сахарозы в водных растворах формамида отсутствуют, но рассмотренные результаты (увеличение времени центрифугирования в 3 раза для 70%-ного раствора формамида) могут служить отправной точкой при эмпирическом подборе оптимальных условий центрифугирования. [c.236]

При центрифугировании денатурированной ДНК или однонитевых РНК бывает необходимо предотвратить их реассоциацию и агрегацию за счет образования случайных водородных связей между основаниями. Для ДНК это осуществляют подщелачива-нием раствора NaOH (до 0,1 М). В случае РНК щелочь непригодна (гидролиз ), но можно создать градиент плотности растворением сахарозы не в воде, а в концентрированных растворах формамида или диметилсульфоксида (ДМСО), иногда даже в 100%-ном формамиде или ДМСО, Полученные градиенты называют денатурирующими градиентами сахарозы . Следует помнить, что ДМСО ядовит и легко проникает через кожу, поэтому работать необходимо в перчатках. Кроме того, ДМСО разрушает нитроцеллюлозные и поликарбонатные пробирки. Из него необходимо удалять следы тяжелых металлов перемешиванием в течение 1,5 ч с 3%-ной суспензией бифункциональной ионообменной смолы. Перед нанесением на градиент препараты нуклеиновых кислот целесообразно прогревать в течение 2— 3 мин при 80 для разрушения уже образовавшихся агрегатов. [c.212]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология