Денатурирующий градиент сахароз

Во втором варианте авторы использовали более широкий (и крутой) интервал концентраций сахарозы (5—25%) и растворяли ее в буфере на основе 70%-ного раствора деионизированного формамида ( денатурирующий градиент ). При тех же значениях частоты вращения ротора и температуры центрифугирование пришлось вести 54 ч (вместо 22 ч). Поли (А)-РНК оказалась в середине пробирки, зат оба маркера (5S и 18S РНК) хорошо видны на градиенте. Использование формамида для полного разворачивания всех молекул РНК (полной денатурации) повышает точность определения s o.a с помощью маркерных РНК, однако за это приходится расплачиваться чуть ли не трехкратным увеличением продолжительности центрифугирования ввиду значительного увеличения плотности и вязкости среды. [c.236]

При высоких значениях pH ДНК денатурирует. Таким образом, денатурированную ДНК можно исследовать в щелочном градиенте сахарозы (т. е. 5—20% сахарозы в 0,1—0,3 М ЫаОН) . [c.319]

Пример 11-М. Обнаружение радиационных повреждений в бактериальной ДНК. При обработке меченной Н-тимидином бактерии ферментом лизоцимом, который разрушает часть клеточной стенки бактерии, и быстром нанесении полученного препарата на щелочной градиент сахарозы лизис бактерии будет завершаться при действии щелочи, а ДНК при этом будет денатурировать. Последующее центрифугирование показывает, что большая часть ДНК имеет очень высокий 5 (рис. 11-35). Если же перед лизисом клетки подвергнуть рентгеновскому облучению, значение 5 существенно понижается, указывая тем самым на то, что облучение приводит к одноцепочечным разрывам. Из эмпирического соотношения между 5 и М можно рассчитать число одноцепочечных разрывов и сравнить его с дозой радиации. Этот подход позволяет установить связь между разрывами цепей и убивающим действием рентгеновских лучей. [c.323]

При центрифугировании денатурированной ДНК или однонитевых РНК бывает необходимо предотвратить их реассоциацию и агрегацию за счет образования случайных водородных связей между основаниями. Для ДНК это осуществляют подщелачива-нием раствора NaOH (до 0,1 М). В случае РНК щелочь непригодна (гидролиз ), но можно создать градиент плотности растворением сахарозы не в воде, а в концентрированных растворах формамида или диметилсульфоксида (ДМСО), иногда даже в 100%-ном формамиде или ДМСО, Полученные градиенты называют денатурирующими градиентами сахарозы . Следует помнить, что ДМСО ядовит и легко проникает через кожу, поэтому работать необходимо в перчатках. Кроме того, ДМСО разрушает нитроцеллюлозные и поликарбонатные пробирки. Из него необходимо удалять следы тяжелых металлов перемешиванием в течение 1,5 ч с 3%-ной суспензией бифункциональной ионообменной смолы. Перед нанесением на градиент препараты нуклеиновых кислот целесообразно прогревать в течение 2— 3 мин при 80 для разрушения уже образовавшихся агрегатов. [c.212]

Щелочной градиент сахарозы используют для денатурации ДНК, обнаружения скрытых разрывов, оценки истинных размеров развернутой молекулы ДНК. При pH 12,1—12,3 линейные молекулы ДНК денатурируют, а плазмиды сохраняют свою двунитевую кольцевую структуру. Щелочные градиенты обычно получают, растворяя сахарозу в 0,1—0,3 М NaOH с 0,7- [c.238]

В настоящее время наиболее подробно охарактеризованы молекулярная масса регуляторного М-белка. Данные, полученные с использованием трех методов идентификации N-белка, дают похожие результаты. Так, Пфейффер с помощью [ Н] Р -(4-азидо-анилид) Р -ГТФ при блокировании мембранных белков эритроцитов голубя показал включение метки в полипептиды с молекулярной массой 86 000, 53 000, 42 000 и 23 000 дальтон [6]. Из них только полипептид с молекулярной массой 42 000 дальтон был связан с аденилатциклазной активностью в детергентном экстракте при центрифугировании в градиенте плотности сахарозы. Этот полипептид, проявляющий биологическую активность регуляторного белка в экспериментах по реконструкции, можно было отделить от аденилатциклазы на аффинном носителе, содержащем ГТФ [6, 7]. Примерно в то же время был обнаружен катализируемый субъединицей холерного токсина перенос [ р] ДДф-ри-бозы от [ Р] НАД+ на мембранный белок, который при денатурирующем электрофорезе дает меченый полипептид с молекулярной массой 42 000—45 000 дальтон [11, 24—27]. [c.96]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология