Полиаденилирование сайты в векторах

Рис. 7.1. Обобщенная структура эукариотического экспрессирующего вектора. Его основные элементы эукариотический транскриптон с промотором (/>), сайтом клонирования (С К) и сигналами терминации и полиаденилирования t) эукариотический селективный маркер (СМ) сайт инициации репликации, функционирующий в клетках эукариот сайт

Рис. 7.13. Обобщенная схема экспрессирующего вектора млекопитающих. Полилинкер (ПЛ) и селективный маркер (СМ) находятся под контролем эукариотического промотора р) и сигнала полиаденилирования (j>a). Репликация вектора в Е. oli и в клетках млекопитающих обеспечивается сайтами инициации репликации ori и соответственно. Для отбора трансформированных клеток Е. oli используется ген устойчивости к ампициллину (АтрО

Рис. 7.15. Двухвекторная система экспрессии. Клонированные гены (а и Р) кодируют субъединицы димерного белка ( Р). После одновременной трансфекции клетки двумя плазмидами в ней синтезируются обе субъединицы и собирается функциональный димерный белок. Оба вектора несут сайты инициации репликации, функционирующие в Е. oli (ori ) и в клетках млекопитающих (о/-/= ) маркерный ген (Amp ) для отбора трансформированных клеток Е. oli, эукариотический промотор (р) и сигнал полиаденилирования (ра), которые регулируют экспрессию селективного маркерного гена (СМ) и каждого из клонированных генов.

Рис. 7.16. Экспрессирующий вектор с двумя независимо транскрибируемыми генами. Клонированные гены (а и (3) кодируют субъединицы димерного белка (ар). Каждый ген встроен в вектор как часть отдельной единицы транскрипции и находится под контролем эукариотического промотора (р) и сигнала полиаденилирования (ра). Каждая субъединица транслируется со своей мРНК объединяясь, субъединицы образуют функциональный димерный белок (ар). Векторы содержат сайты инициации репликации, функционирующие в Е. соИ (оп ) и в клетках млекопитающих (р /сик) маркерный ген (Amp ) для отбора трансформированных клеток Е. oli, селективный маркерный ген (СМ), находящийся под контролем эукариотических промотора (р) и сигнала полиаденилирования (ра).

Рис. 7.17. Двухцистронный экспрессирующий вектор. Клонированные гены (а и (3) кодируют субъединицы димерного белка (а 3). Они разделены сегментом ДНК, который после транскрипции, на уровне мРНК, играет роль внутреннего сайта связывания рибосом. Каждый ген находится под контролем эукариотических промотора (р) и сигнала полиаденилирования (ра). Трансляция мРНК начинается с 5 -конца и с внутреннего сайта (угловые стрелки). Синтезированные субъединицы объединяются с образованием функционального димерного белка. Вектор содержит сайты инициации репликации, функционирующие в Е. соИ orf) и в клетках млекопитающих (orF y, селективный маркерный ген (Amp ) для отбора трансформированных клеток Е. соИ селективный маркерный ген (СМ), находящийся под контролем эукариотических промотора (р) и сигнала полиаденилирования (ра).

Экспрессионные векторы. Их используют для анализа конкретных последовательностей генов и их белковых продуктов, а также наработки конкретного белка. Существует огромное количество экспрессионных систем, особенно для прокариотических организмов. Есть также векторы для экспрессии генов в клетках дрожжей, растений и млекопитающих. Экспрессионные векторы для эукариотических организмов всегда содержат так называемую экспрессионную кассету, состоящую из промотора, способного работать в данном организме и сайта полиаденилирования. [c.36]

Рис. 6.7. Челночный прокариотически-эукариотический вектор pSEM atR. Если смотреть против часовой стрелки, этот вектор включает ген, кодирующий устойчивость к ампициллину, участок начала репликации pBR322, промотор области ранних генов SV-40, содержащий ТАТА-бокс Голдберга — Хогнесса, промоторную область гена AT (хлорамфеникол-ацетилтрансферазы), содержащую сайт начала транскрипции (этот ген кодирует устойчивость к антибиотику хлорамфениколу), интрон малого t-антигена и сайт полиаденилирования области ранних генов вируса SV-40.

Этот подход избавляет нас от необходимости выделять специфический мутант, поскольку он подразумевает использование бактериальных генов, которые дают селективные преимущества при их экспрессии в клетках млекопитающих [28]. Для этого конструируют плазмидные и ретровирусные векторы, в которых бактериальные гены сочетаются с промоторами, местами сплайсинга и сигналами полиаденилирования млекопитающих. Введение бактериальных генов в клетки млекопитающих с по--мощью трансфекции или инфекции приводит к их случайному распределению в геноме реципиента. В качестве примера бактериальных генов, способных обеспечивать селективные преимущества клеток млекопитающих, можно назвать ген Е. oli gpt (он позволяет клеткам-реципиентам утилизировать ксантин в качестве предшественника для биосинтеза пуринов) и генлео (он обусловливает устойчивость клеток млекопитающих к антибиотику G418) [29]. Основной недостаток этого метода — случайное распределение сайтов интеграции однако последние исследования позволяют надеяться, что с помощью гомологичной рекомбинации удастся осуществлять направленную интеграцию. [c.12]

Рис. 13.6 Строение плазмидных векторов pSV2-gpt (а), pMSG (б) и pFV-2 (в). рА и pAj — сайты полиаденилирования, (соответственно вируса SV40 и гена гормона роста лосося) t — малый t-интрон

Плазмиды без эукариотического репликатора. Замена в плазмидах типа pSV промотора SV40 на промотор вируса саркомы Рауса, расположенного в его LTR-повторе, дела экспрессию селектируемых генов в образовавшихся векторах pRS V-gp/n pRSV-пео еше более эффективной. Конечно, эти векторы тспользуют для наблюдения временной экспрессии. Этой же цели служат и аналогичные векторы серии pFV, предназначенные для экспрессии чужеродных генов в клетках рыб (Liu et al, 1990). Их экспрессионная кассета состоит из промотора, энхансера и интрона гена (3-актина карпа и сайта полиаденилирования гена гормона роста лосося (рис. 13.6,в). Примечательно, что эта кассета работает и в клетках животных. [c.408]

Смотреть страницы где упоминается термин Полиаденилирование сайты в векторах: [c.139] [c.141] [c.144] [c.150] [c.153] [c.390] [c.391] [c.393] [c.202] [c.168] [c.26] [c.364] [c.134] [c.139] [c.177] [c.168] [c.371] [c.384] [c.398] [c.400] [c.406] [c.408] [c.409] [c.265] [c.265] [c.355]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология