Селективные маркерные гены

Рис. 21.3. Генетическая карта ретровирусного вектора, несущего два гена. Транскрипция терапевтического гена (Ген X) контролируется 5 -LTR-промотором, транскрипция селективного маркерного гена (Neo ) — внутренним промотором (р). 3 -LTR содержит сигнал полиаденилирования. - последовательность, ответственная за упаковку.

Селективные маркерные гены [c.33]

Если вектор представляет собой плазмиду, реплицирующуюся независимо от хромосомы, то он должен содержать сайт инициации репликации, функционирующий в хозяйской клетке. Если же вектор предназначен для встраивания в хозяйскую хромосомную ДНК, то для обеспечения рекомбинации он должен нести последовательность, комплементарную определенному участку хромосомной ДНК хозяина (хромосомный сайт интеграции). Поскольку технически многие операции с рекомбинантными ДНК сложнее проводить в клетках эукариот, чем прокариот, большинство эукариотических векторов сконструированы как челночные. Другими словами, эти векторы несут два типа сайтов инициации трансляции и два типа селективных маркерных генов, одни из которых функционируют в Es heri hia oli, а другие — в эукариотических хозяйских клетках. Такие векторные системы экспрессии разработаны для дрожжей, насекомых и клеток млекопитающих. [c.136]

Обычно при введении чужеродного гена в растение одновременно вводится и селективный маркерный ген. Хотя до сих пор не было никаких указаний на то, что какой-либо из этих генов оказывает неблагоприятное воздействие на человека, животных или окружающую среду, последствия, к которым в принципе может привести включение в растения селективных маркерных генов, вызвали беспокойство общественности. Например, продукты некоторьгх маркерных генов могут оказаться аллергенами или токсичными веществами, а гены устойчивости к антибиотикам могут попасть в патогенные почвенные микроорганизмы. Кроме того, присутствие селективных маркеров технически затрудняет трансформацию трансгенных растений дополнительными генами, поскольку один селективный маркер не может использоваться дважды. Чтобы успокоить общественность, были разработаны методы получения трансгенных растений без ка-ких-либо маркерных генов. [c.386]

Рис. 17.9. Схематическое представление Т-ДНК, входящей в состав вектора. После интеграции Т-ДНК в хромосомную ДНК растения транспозаза может вырезать селективный маркерный ген и встроить его в другой хромосомный сайт. Обозначения Л и П — левая и правая фланкирующие последовательности, Ве — мобильный элемент. Промоторы и сигналы терминации транскрипции гена транспозазы, гена, интересующего исследователя, и селективного маркерного гена не показаны.

Для получения больших количеств чужеродных белков с помощью рекомбинантных штаммов Е. соИ бьша сконструирована плазмида pPL 2833. Она содержит сильный промотор, селективный маркерный ген и короткий участок с несколькими уникальными сайтами для рестрицирующих ферментов (полилинкер), следующий непосредственно за промотором. Эффективность этого экспрессирующего вектора в осуществлении синтеза чужеродных белков в Е. соН можно еще [c.108]

Селективный маркерный ген, функционирующий в клетках животных. [c.241]

ДНК между Вз-элементами и перемещает его в другой хромосомный сайт (рис. 17.9). В процессе встраивания Т-ДНК в ДНК растения-хозяина в 90% случаев селективный маркер, находящийся между двумя Вз-элементами, оказывается в другом сайте хромосомной ДНК, при этом с вероятностью 50% этот сайт находится далеко от исходного. Таким образом, селективный маркерный ген может использоваться для идентификации трансформированных растений, а затем удаляться при скрещивании. [c.386]

Рис. 7.17. Двухцистронный экспрессирующий вектор. Клонированные гены (а и (3) кодируют субъединицы димерного белка (а 3). Они разделены сегментом ДНК, который после транскрипции, на уровне мРНК, играет роль внутреннего сайта связывания рибосом. Каждый ген находится под контролем эукариотических промотора (р) и сигнала полиаденилирования (ра). Трансляция мРНК начинается с 5 -конца и с внутреннего сайта (угловые стрелки). Синтезированные субъединицы объединяются с образованием функционального димерного белка. Вектор содержит сайты инициации репликации, функционирующие в Е. соИ orf) и в клетках млекопитающих (orF y, селективный маркерный ген (Amp ) для отбора трансформированных клеток Е. соИ селективный маркерный ген (СМ), находящийся под контролем эукариотических промотора (р) и сигнала полиаденилирования (ра).

В специфический хромосомный сайт Е8-клеток можно не только встроить трансген, кодирующий какую-то новую функцию, но и направленно разрушить этот сайт интеграцией с его кодирующей областью специфической последовательности (обычно селективного маркерного гена) (рис. 19.7). Одна из задач направленного нарущения ( нокаута ) гена состоит в исследовании влияния этого процесса на развитие организма и протекающие в нем физиологические процессы. Кроме того, есть надежда, что трансгенных животных с нарушением в определенном гене можно использовать как модель для изучения болезней человека на молекулярном уровне. [c.425]

Таблица 17.4. Системы репортерных и селективных маркерных генов растительных клеток

Селективные маркерные гены Для отбора трансфицированных клеток млекопитающих часто используют бактериальный ген Neo кодирующий неомицинфосфотрансфера-зу. В этой системе применяется токсичное соединение генетицин (G-418), блокирующее трансляцию в нетрансфицированных клетках млекопитающих. При этом в трансфицирован- [c.150]

Рис. 7.15. Двухвекторная система экспрессии. Клонированные гены (а и Р) кодируют субъединицы димерного белка ( Р). После одновременной трансфекции клетки двумя плазмидами в ней синтезируются обе субъединицы и собирается функциональный димерный белок. Оба вектора несут сайты инициации репликации, функционирующие в Е. oli (ori ) и в клетках млекопитающих (о/-/= ) маркерный ген (Amp ) для отбора трансформированных клеток Е. oli, эукариотический промотор (р) и сигнал полиаденилирования (ра), которые регулируют экспрессию селективного маркерного гена (СМ) и каждого из клонированных генов.

Рис. 7.16. Экспрессирующий вектор с двумя независимо транскрибируемыми генами. Клонированные гены (а и (3) кодируют субъединицы димерного белка (ар). Каждый ген встроен в вектор как часть отдельной единицы транскрипции и находится под контролем эукариотического промотора (р) и сигнала полиаденилирования (ра). Каждая субъединица транслируется со своей мРНК объединяясь, субъединицы образуют функциональный димерный белок (ар). Векторы содержат сайты инициации репликации, функционирующие в Е. соИ (оп ) и в клетках млекопитающих (р /сик) маркерный ген (Amp ) для отбора трансформированных клеток Е. oli, селективный маркерный ген (СМ), находящийся под контролем эукариотических промотора (р) и сигнала полиаденилирования (ра).

Внехромосомные экспрессирующие векторы млекопитающих обычно применяют для синтеза гетерологичных белков, использующихся в научных или медицинских целях. Они представляют собой челночные векторы с сайтами инициации репликации вируса животных и Е. со//-плазмиды. Регуляторные элементы транскрипции обычно происходят из генома вируса животных или из геномов млекопитающих. Для отбора трансфицированных клеток используют доминантные селективные маркерные гены. Некоторые системы отбора основаны на введении в среду возрастающего количества цитотоксичного соединения и позволяют получать клетки, содержащие большое число копий вектора, что увеличивает выход чужеродного белка. [c.155]

Селективный маркерный ген, например ген неомицинфосфотрансферазы, который обеспечивает устойчивость трансформированных растительных клеток к канамицину. Поскольку этот ген (как и многие другие маркерные гены, используемые при трансформации растений) по своей природе прокариотический, необходимо поставить его под контроль растительных (эукариотических) сигналов регуляции транскрипции, в том числе промотора и сигнала терминации-полиаде-нилирования. Это обеспечит эффективную экспрессию гена в трансформированных растительных клетках. [c.377]

В рамках другого подхода селективный маркерный ген встраивают между растительными мобильными элементами (В5-элементами) и такую конструкцию вводят в Т-ДНК вместе с геном транспозазы, которая вырезает участок [c.386]

Рис. 19.7. Нокаут гена с помощью направленной гомологичной рекомбинации. Вектор несет селективный маркерный ген (8т ) и фланкирующие его последовательности, гомологичные соответствующим участкам гена-мишени. Последний содержит пять экзонов (1 —5). В результате гомологичной рекомбинации (штриховые линии) ген-мищень прерывается ( нокаутируется ).

Векторы этого типа представляют собой производные Ti-плаз-мид дикого типа, из которых онкогены Т-ДНК были удалены и в некоторых случаях заменены на особый фрагмент ДНК, имеющий область гомологии с небольшим клонирующим вектором, способным реплицироваться только в Е. oli. Эта стратегия основана на коинтеграции в клетках А. tumefa iens между гомоло-гичны.ми областями на модифицированной Ti-плазмиде vir-хел-пере) и небольшом клонирующем (промежуточном) векторе Е. oli, содержащем селективный маркерный ген, который предназначен для работы в растительных клетках, и уникальные сайты для встраивания чужеродной ДНК- [c.20]

Селективный марк81Жый ген для растений Бактериальный селективный маркерный ген Точка начала репликации плазмиды с широким кругом хозяев OS -сайт [c.28]

Следует учитывать две основные особенности маркерных генов. Во-первых, их структуру (нуклеотидную последовательность), которая определяет такие факторы, как регуляция транскрипции (конститутивная экспрессия или включение под действием определенных внешних условий или стадии развития), скорость транскрипции, стабильность транскрипта и эффективность трансляции. Во-вторых, активность продукта данного гена, который, очевидно, отвечает за доминантную экспрессию подходящего селективного фенотипа. В большинстве обычных векторов трансформации в качестве селективных маркеров используют прокариотические ферменты устойчивости к антибиотикам, которые были адаптированы с помощью генно-инженерных методов для конститутивного синтеза в растительных клетках (табл. 2.1). В некоторых экспериментах в качестве доминантных маркеров успешно использовались ферменты, обеспечивающие защиту от гербицидов. Обычно добиваются слияния кодирующей последовательности фермента с промоторами, выделенными из Т-ДНК или генома вируса мозаики цветной капусты (ВМЦК), на 5 -конце, а на З -конце —с сигналом полиаденилирования (тоже полученным, как правило, из какого-либо гена Т-ДНК). В качестве маркерных генов наиболее широко используют гены устойчивости к таким антибиотикам, как канамицин, G418 [8, 27], гигромицин [54] и блеомицин [28] Недавно для трансформации растительных клеток в качестве доминантных маркеров были попользованы гены, обеспечивающие устойчивость к гербицидам, таким, как глифосат [45]. Поскольку селективные маркерные гены нормально функционируют в трансформированных [c.33]

Примеры векторных систем, содержащих разнообразные селективные маркерные гены, обсуждались в гл. 1, а используемые в настоящее время селективные фенотипы представлены в табл. 2.1. Хотя можно предположить, что маркерные гены эффективно экспрессируются у большинства, если не у всех видов растений, следует проявлять осторожность в выборе маркерного гена, поскольку различные виды растений чрезвычайно варьируют по признаку чувствительности к селективным агентам. Например, устойчивость к канамицину успешно использовалась в качестве селективного фенотипа при трансформации различных видов растений (приложение 2[VIII]), но в отношении других видов растений канамицин иногда неэффективен. Это обусловлено либо толерантностью к высоким уровням этого соединения, либо гиперчувствительностью, приводящей к массово- [c.96]

Селективный агент, чтобы быть полезным, должен создавать сильное селективное давление в отношении рассматриваемой ткани растения. Эффективность отдельных соединений как селективных агентов способна меняться в зависимости от типа выбранного эксплантата или селектируемой ткани. Например, уровень дифференциации, тип и размер эксплантата, подвергаемого давлению селективной среды (протопласт, клетка, колония клеток, суспензионный агрегат клеток, клетки суспензии, вступившие в эмбриогенез, быстро растущие изолированные каллусы, регенерирующий каллус, каллус, прикрепленный к эксгалантату, изолированный побег, побег, прикрепленный к эксплантату или каллусу, корень, эмбрион, проросток), —все это влияет на применимость любого селективного маркерного гена в каждом конкретном случае. Нельзя предполагать, что фенотип, представляющий собой хороший селективный маркер для какой-либо ткани одного вида растения, будет столь же эффективен для других разновидностей (и даже для других эксплантатов) того же вида. [c.97]

Селективные маркерные гены Фермент (сокращенное обозначение) Субстраты (селективные агенты) Чувствительность ткани контрольного растения (мкг/мл) ) Конструкции HO TK. обеспечиваемые различны мн конструкциями (мкг/мл) [c.98]

Б. Онкогенный штамм А. tumefa iens, содержащий доминантный селективный маркерный ген (например, pTiB6S3 pMON 200 содержит nos-npt-II-гш, способный, как известно, к эффективной экспрессии в растительных клетках [30]). [c.111]

Располагая изложенными выше сведениями, можно воспроизвести эксперименты, (Используя онкогенные штаммы агробактерий, содержащие векторы с доминантными селективными маркерными генам , и подбирая соответствующие условия (например, концентрацию антибиотиков и временной режим после-ияокуляции до применения селекции). Это обеспечит селекцию резистентных к антибиотику трансформированных клеток на средах, не содержащих добавок фитогормонов ). [c.114]

LBA4404(pBin 19) — штамм с бинарным вектором, содержащим селективный маркерный ген nos-npt-II, неонкогенной плазмидой и Uir-ПОМОЩНИКОМ. [c.121]

Ночная культура (разд. 1.3) неонкогенного штамма агробактерий с селективным маркерным геном [например, С58С1 (pGV3850 1103) содержит ген nos-npt-II, который сообщает трансформированным растительным клеткам устойчивость к канамицину]. [c.135]

Колонии трансформированных растительных клеток можно отбирать или путем высева на безгормональные среды в случае опс+-векторов, или путем высева на среды, содержащие в норме высокие концентрации токсичных антибиотиков, если в опс -векторы включены доминантные селективные маркерные гены (например, резистентности к канамицину). Известно несколько важных моментов, касающихся условий селекции. [c.156]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология