Зародышевые линии клеток и трансфекция

Рис. 38.14. С помощью трансфекции можно вводить ДНК в клетки зародышевых линий животных.

Рис. 19.14. Получение трансгенных цыплят трансфекцией изолированных клеток бластодермы. Выделенные клетки трансфицируют трансгеном с помощью липосом и вводят в подзародышевую область облученной бластодермы реципиента. Часть полученных потомков являются химерами, а некоторые из них, несущие трансген в клетках зародышевой линии, при скрещивании могут дать начало трансгенным линиям.

Никаких специфичных для птиц ES-клеток не обнаружено, поэтому подход, основанный на их использовании, для птиц неприменим. Более перспективным представляется метод с использованием рекомбинантных эмбриональных клеток. Он состоит в следующем. Выделяют клетки бластодермы из куриного эмбриона, трансфицируют их с помощью катионных липидов (липосом), связанных с трансгенной ДНК (липосомная трансфекция), и повторно вводят в подзародыше-вую область свежеотложенных яиц (рис. 19.14). Часть потомков будет нести в каком-то небольшом количестве клетки донора таких животных называют химерами. У некоторых химер клетки, произошедшие от трансфицированных клеток, могут образовывать линии зародышевых клеток, и после нескольких раундов скрещиваний таких химер можно получить линии трансгенных животных. Чтобы увеличить вероятность создания химер, несущих чужеродные гены в клетках зародышевой линии, число донорских клеток в химерах можно увеличить облучением эмбрионов реципиента перед введением в них трансфицированных клеток (540-660 рад в течение 1 ч). Под действием облучения некоторые (но не все) клетки бластодермы погибнут, и соотношение между трансфицированными клетками и клетками реципиента увеличится в пользу первых. По-видимому, таким образом можно получать трансгенных цыплят, хотя и с малой эффективностью. [c.438]

Клетки колонизируют эмбрион и участвуют в его нормальном развитии, давая начало клеткам всех типов соматических тканей и нередко клеткам зародышевого пути. Прежде чем инъецировать ES-клетки в бластоцисту, в них вводят целевые трансгены — либо путем трансфекции, либо инфицируя их рекомбинантными ретровирусами. Практическое достоинство этой методической схемы состоит в том, что она дает возможность проводить селекцию трансформированных ES-клеток по определенному параметру. Это может быть число копий трансгена, его хромосомная локализация или характер экспрессии. Все получаемые по такой схеме первичные трансгенные животные — мозаичные организмы, которые состоят из содержащих и не содержащих трансген клеток поэтому для получения чистых трансгенных линий необходима селекционная работа. Между тем довольно часто ES-клетки оказываются не способными колонизировать зародышевые ткани, что, по всей вероятности, объясняется накоплением хромосомных нарушений в процессе культивирования и селекции in vitro. [c.450]

Недавно у мышей удалось осуществить замену гена косвенным, достаточно трудоемким путем. Процедура сводится к следующему. Сначала фрагмент ДНК, содержащий нужный мутантный ген, вводят путем трансфекции в специальную линию плюрипотентных стволовых клеток, выделенных из эмбриона и выращиваемых в культуре. Клеткам дают возможность размножаться в течение некоторого времени, после чего методом блот-анализа по Саузерну выявляют редкие колонии, в которых общая рекомбинация привела к замене гена, и отдельные клетки из этих колоний имплантируют в ранний эмбрион мыши. В этой новой для них среде выделенные из эмбриона стволовые клетки часто пролиферируют, образуя крупные участки в теле нормальной мыши. Мышей, у которых произошла замена гена в клетках зародышевого пути, скрещивают, чтобы получить самца и самку, которые окажутся гетерозиготными по этому признаку (т. е. будут иметь одну нормальную и одну мутантную копию данного гена). Если теперь скрестить этих животньк, то одна четвертая часть их потомства будет гомозиготной по [c.339]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология