Электропорация временная экспрессия

Временная экспрессия векторной ДНК в популяции обработанных протопластов. Для этого требуется измерить активность фермента, кодируемого вектором, например AT, в грубых лизатах протопластов, подвергшихся электропорации [12]. [c.215]

Оптимизация методик электропорации с помощью временной экспрессии [c.216]

Один из ПОДХОДОВ к определению оптимальных условий для электропорации протопластов состоит в анализе временной экспрессии гена в составе ДНК, которую вводят в клетки. [c.216]

В разд. 3.2 мы остановимся на том, как определить оптимальные условия для введения векторной ДНК в протопласты в присутствии ПЭГ, оценивая количество используемой ДНК. Поглощение ДНК контролируется с помощью гибридизации, чтобы подтвердить включение векторной ДНК в протопласты. В разд. 3.3 изложены методики электропорации протопластов и оценки эффективности процесса трансформации путем измерения временной экспрессии DMGT-вектора в клетках, полученных из обработанных протопластов. Трансформация протопластов путем микроинъекций описана в разд. 3.4. [c.203]

С помощью электропорации были получены стабильно трансформированные растения или клеточные линии некоторых видов растений. К йх числу относятся табак [38], морковь [22] и кукуруза [13]. Шиллито с соавторами [38] использовал вектор, содержащий доминантный селективный маркерный ген (npt-ll), который ранее успешно применяли в экспериментах по пере носу генов с помощью ПЭГ [31]. Эту плазмиду вводили с помощью электропорации в протопласты табака и отбирали трансформанты на основе резистентности к канамицину. Дан<-ные исследования, очевидно, отнимают больше времени, чем эксперименты по временной экспрессии, но в конечном итоге позволяют разработать методику стабильной трансформации. В настоящее время при использовании методов электропорации частота трансформированных колоний может достигать 2%. что более эффективно, чем трансфекция ДНК с помощью ПЭГ. Пути интеграции перенесенной ДНК такие же, как и при иС пользовании ПЭГ, и в обоих случаях перенесенные гены наследуются в соответствии с нормальными менделевскими соотношениями. [c.216]

L Определяют активность AT, как указано в разд. 6.4.2. На рис. 3.6 показаны результаты эксперимента, в котором в протопласты Р. hybrida вводили p aMV AT путем электропорации с помощью прибора Kruss и описываемой методики. Очевидно, что напряженность 2000 В/см и длительность импульса 10 мкс обеспечивают оптимальный уровень временной экспрессии AT при ограниченных потерях выживаемости протопластов. [c.219]

Работа, проведенная Фроммом с соавторами [12], помогла определить условия, дающие максимальную экспрессию легко скринируемого продукта индикаторного гена (хлорамфениколацетилтрансферазы, AT) после электропорации протопластов векторной ДНК, несущей этот ген (анализ данного фермента описан в разд. 6.4.2). В этих экспериментах было показано, что эффективность электропорации, которая измеряется количеством ДНК, поглощенной протопластами, можно количественно связать с активностью AT. Поэтому оптимизация методики электропорации заключается в том, чтобы подвергать популяцию протопластов различным по напряжению, длительности и времени спада импульсам, а также использовать серии импульсов, а затем анализировать через соответствующее время активность AT. Результаты таких экспериментов менее прямые, чем кажется на первый взгляд, поскольку увеличение напряжения и длительности импульса приводит к пропорцио нальному увеличению гибели клеток. В результате величина ак тивности AT, выявленной в популяции протопластов, недо оценивает количество вектора, включенного каждой клеткой Поэтому эффективность электропорации зависит от того, изме ряют ли ее на всей исходной популяции или на тех клетках, которые остаются жизнеспособными после обработки. Фромм с соавторами [12] сообщил, что импульс длительностью 54 мс при 350 В обеспечивает максимальную активность AT и она достигает пика через 24—48 ч после электропорации. Однако [c.215]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология