Полилинкер

Рис. 20.29. Улавливание экзонов. А. Вектор для улавливания экзонов содержит искусственный ген, состоящий из промотора р, двух экзонов, разделенных интроном, который несет полилинкер, и сайта терминации транскрипции 1. После введения вектора в эукариотическую клетку искусственный ген транскрибируется и из первичного транскрипта удаляется интрон. Для получения ПЦР-продукта определенной длины, который содержит часть обоих экзонов, используют ПЦР-амплификацию обратного транскрипта.

На самом деле, реальные векторы должны обладать еще целым рядом свойств в зависимости от целей их применения. Так, очень важно, чтобы вектор позволял осуществлять вставку чужеродной ДНК различной молекулярной массы и чтобы свойства вектора давали возможность различать клоны бактерий, несущих исходные векторные и рекомбинантные молекулы. Удобно работать с небольшими по размеру векторами, которые к тому же дают большое число копий на клетку, что облегчает выделение и очистку векторной и рекомбинантной ДНК. Векторная молекула должна иметь как можно больше единичных последовательностей, узнаваемых различными рестриктазами, что может обеспечиваться введением полилинкеров. Лучше всего разработана система вектор — хозяин для бактерий Е. соИ. В этом случае используется четыре типа векторов 1) плазмиды 2) бактериофаг Я. 3) производные бактериофага Я, (космиды и фазмиды) [c.143]

Рис. 6.5. Клонирующий вектор pAVlO (без соблюдения масштаба). Показано положение гена устойчивости к тетрациклину (Tef), сайта рестрикции для эндонуклеазы Bglll, сайта инициации репликации (ori), промотора (р) и полилинкера (ПЛ). Встраивание клонированного гена в полилинкер ставит его под контроль промотора Тп5 (р). Стрелка указывает направление транскрипции.

Для получения больших количеств чужеродных белков с помощью рекомбинантных штаммов Е. соИ бьша сконструирована плазмида pPL 2833. Она содержит сильный промотор, селективный маркерный ген и короткий участок с несколькими уникальными сайтами для рестрицирующих ферментов (полилинкер), следующий непосредственно за промотором. Эффективность этого экспрессирующего вектора в осуществлении синтеза чужеродных белков в Е. соН можно еще [c.108]

Многие белки, продуцируемые Е. соН, накапливаются в клетках в форме нерастворимых биологически неактивных телец включения. И хотя из таких структур часто удается получать в небольших количествах биологически активный белок, для этого приходится проводить продолжительную солюбилизацию. Плохая растворимость белков in vivo часто обусловливается их неправильной укладкой, и эту проблему пытались рещить различными способами. Так, известно, что химерные белки, одним из компонентов которых является тиоредоксин, белок мол. массой 11,7 кДА, остаются в растворе, даже если на их долю приходится 40% суммарного клеточного белка. Имея это в виду, ген-мищень встроили в полилинкер сразу вслед за геном ти-оредоксина, так чтобы оба этих гена попали под контроль / "-промотора в плазмидном векторе Е. соИ (рис. 6.9). В хромосоме хозяйских клеток Е. соИ, использующихся в этой системе, присутствует генетическая конструкция, детерминирующая образование репрессора с — копия гена с1, находящаяся под транскрипционным контро- [c.114]

Рис. 7.13. Обобщенная схема экспрессирующего вектора млекопитающих. Полилинкер (ПЛ) и селективный маркер (СМ) находятся под контролем эукариотического промотора р) и сигнала полиаденилирования (j>a). Репликация вектора в Е. oli и в клетках млекопитающих обеспечивается сайтами инициации репликации ori и соответственно. Для отбора трансформированных клеток Е. oli используется ген устойчивости к ампициллину (АтрО

Полилинкер (множественный сайт клонирования) для встраивания гена в участок между границами Т-ДНК. [c.377]

Рис. 8.3. Олигонуклеотид-направлен-ный мутагенез с использованием плазмидной ДНК. Ген-мишень встраивают в полилинкер вектора pALTER. Плазмидную ДНК денатурируют в щелочи и отжигают с тремя олигонуклеотидами мутагенным олигонуклеотидом, олигонуклеотидом, восстанавливающим устойчивость к ампициллину (Amp ), и олигонуклеотидом, придающим чувствительность к тетрациклину (Tef ). Эти олигонуклеотиды служат затравками для синтеза ДНК с помощью ДНК-по-лимеразы Т4, а исходная цепь - матрицей. Одноцепочечные разрывы в новосинтезированной цепи зашиваются ДНК-лигазой Т4. Продуктами реакции трансформируют клетки Е. соН и отбирают трансформантов Amp и Tet.

Полилинкер (Polylinker) Короткий участок ДНК, содержащий несколько уникальных сайтов узнавания для эндонуклеаз в эти сайты встраивают чужеродную ДНК (осуществляют клонирование). [c.557]

Основное достоинство генетического подхода — быстрота и эффективность метода достаточно большое число экспериментов можно проводить параллельно. Поэтому не возникает нужды в повторном скрининге, что делает этот метод особенно удобным там, где требуется повторное выделение многих космид (например, при прогулке по хромосоме ). Другое преимущество генетического метода — очень высокая чувствительность гомологичной рекомбинации к ошибочному спариванию последовательностей [25, 26], Данное обстоятельство может быть особенно удобным, например, при выделении космид, содержащих конкретные копии тех или иных семейств генов, или в экспериментах по прогулке по хромосоме . Такие эксперименты упрощаются при работе с некоторыми из наших новых векторов (Эрих и др., в печати), содержащих ЫоИ-сашы, фланкирующие инсерционный сайт, что позволяет провести быстрое и избирательное клонирование концевых фрагментов вставки в производных риС18 или рЕМВЬ18, содержащих 7Уо/1-сайты в полилинкере. [c.84]

В случае простейшего ретровирусного вектора транс-дейст-вующие вирусные структурные гены удаляют и на их место встраивают один или несколько рестрикционных сайтов для клонирования. Известно несколько векторов этого типа (см., например, [18, 19]). В качестве примера вектора, рассчитанного на клонирование одиночных генов, можно назвать вектор на основе вируса лейкоза мышей Молони (Mo-MLV), обозначаемый рМХ1112 (рис. 9.3, а). В этой конструкции полилинкер содержащий множественные рестрикционные сайты для клонирования, введен на место удаленных вирусных генов gag, pol и env. Клонированный в данном векторе чужеродный ген эффективно экспрессируется благодаря промотору в составе вирусного 5 -LTR, а наличие ч с-действующих вирусных последовательностей позволяет этой системе формировать инфекционные части- [c.279]

На рис. 26 приведен один из векторов на основе фага М13. Следует отметить, что для репликации этого фага используется весь его геном, за исключением небольшой области (507 и.о.), названной межгенной последовательностью. Именно только ь эту область можно встроить чужеродную ДНК. Обычко вставляют полилинкер (рис. 27), что делает вектор более универсальным, так как появляется возможность применять для клонирования разные рестриктазы. В приведенном на рисунке векторе и во многих других в межгенной области находится N-концевой участок гена -галактозидазы со встроенным в него полилинкером. [c.152]

Рис. 27. Универсальный вектор для клонирования Blus ribe М13 Внизу представлена последовательность оснований в полилинкере

Отбор рекомбинантных фагов основан на нарушении а-компле-ментации при встраивании в полилинкер дополнительного фрагмента ДНК. При инфекции клеток вектором образуются голубые колонии, рекомбинанты бесцветны. [c.153]

После знакомства с различным типом векторов приведем пример современного унивёрсального вектора для клонирования чужеродной ДНК (рис. 27). Он содержит сильные промоторы фагов ТЗ и Т7. Эти промоторы были синтезированы химически с наименьшей гомологией между ними для предотвращения образования шпилечных структур. Вставка любого фрагмента ДНК в полилинкер эффективно транскрибируется под контролем промотора фага Т7 или ТЗ (в зависимости от ориентации клонированного фрагмента). [c.153]

Во многих трансформирующих векторах присутствуют только один или два удобных рестрикционных сайта для клонирования, тогда как другие более универсальны и содержат ряд удобных сайтов в полилинкере, иногда расположенном в области а-комплементации -галактозидазы, что позволяет обнаружить трансформированные рекомбинантные бактериальные клоны на чашках с X-GAL/ИПТГ (табл. 1.1 и 1.2). [c.35]

Рис. 6.17. Система слияния на основе гена GUS Л — строение основного вектора рБ1 101 для слияния с геном GUS. Приведен пример его использования с двумя промоторными последовательностями растений. 5 — нуклеотидная последовательность области слияния в полилинкере векторов, предназначенных для слияния с геном GUS. Инициаторные кодоны GUS выделены жирным шрифтом. Рестрикционные сайты ВатШ подчеркнуты.

Справочник химика 21

Химия и химическая технология