Клонирование геномной ДНК

Зонды для скрининга геномной библиотеки можно получить по крайней мере двумя способами. Во-первых, можно использовать клонированную ДНК близкородственного организма (гетерологичный зонд). В этом случае условия гибридизации нужно подбирать таким образом, чтобы она могла происходить при существенном расхождении между нуклеотидными последовательностями зонда и искомой ДНК это позволяет решить проблемы, связанные с заведомым различием между ДНК - источником зонда и исследуемой ДНК. Во-вторых, зонд можно получить методом химического синтеза, основываясь на известной аминокислотной последовательности белкового продукта искомого гена. [c.67]

Чтобы иметь возможность клонировать целый ген, донорную ДНК расщепляют лишь частично. При этом получаются фрагменты разной длины, из которых затем создают геномную библиотеку. Для клонирования крупных фрагментов ДНК были сконструированы векторы на основе бактериофагов X и Р1, а также плазмиды Р. [c.78]

ВАС-векторы получены на основе F-плазмид бактерий и содержат гены, ответственные за репликацию и копийность этих плазмид в бактериальных клетках, и ряд дополнительных последовательностей для облегчения клонирования. Емкость ВАС-векторов при собственном небольшом размере ( 7 т. н. п.) огромная — 100—300 т. н. п. Это позволяет во много раз уменьшить число клонов при получении геномных библиотек (см. ниже). [c.41]

Геномная библиотека (банк генов) представляет собой клонированный в составе векторов полный набор последовательностей ДНК данного организма. Фрагментация целого генома на отдельные участки значительно облегчает все генно-инженерные манипуляции и позволяет анализировать отдельные последовательности, проводить сравнительный анализ различных геномов по определенным участкам и, главное, выделять и работать с индивидуальными генами. [c.41]

ГЕННАЯ КОНВЕРСИЯ, Изменение одной из цепей гетеродуплексной ДНК, приводящее к комплементарности с другой цепью в тех положениях, где есть неспаренные основания, ГЕНОМНЫЕ (ХРОМОСОМНЫЕ) КЛОНЫ ДНК. Последовательности геномной ДНК, клонированные в составе вектора. ГЕНОТИП. Совокупность генов организма. ГЕТЕРОГАМЕТНЫЙ ПОЛ. Характеризуется хромосомным набором 2А + XY. [c.520]

В ходе клонирования геномных копий было получено два варианта клонов, различающихся между собою по рестриктной карте. Они представляют собою два аллельных варианта гена р53, встречающихся в человеческой популяции. Оба варианта кодируют полноценный белок, хотя даже в аминокислотной последовательности белка имеются небольшие различия. [c.44]

Рис. 1. Метод РНКазного расщепления. Равномерно меченный одноцепочечный РНК-зонд транскрибируется с клонированной ДНК-матрицы. Зонд смешивают с двухцепочечным тестируемым фрагментом клонированной (геномной или амплифицированной в ПЦР) ДНК, и смесь нагревают для разделения цепей. Проводят отжиг РНК-зонда с комплементарной ему последовательностью в тестируемой ДНК и получают гибридные дуплексы. Если во фрагменте ДНК имеется единичная нуклеотидная замена, то в гибриде РНК—ДНК окажется однонуклеотидный неспаренный участок. Реассоцнированный образец обрабатывают РНКазой А, которая расщепляет цепь РНК по неспаренным участкам. Отметим также, что РНКаза А удаляет выступающие 3 - н 5 концы дуплекса. Дуплекс обрабатывают денатурирующими веществами для разделения цепей, затем проводят электрофорез в денатурирующем (сиквенсном) геле и фрагменты РНК фракционируют по размеру. Гель высушивают и экспонируют с рентгеновской пленкой. Если в тестируемой ДНК нет мутаций, на радиоавтографе наблюдается одна полоса, соответствующая по размеру длине

Рис. 4. Выявление единичных нуклеотидных замен методом ДГГЭ. Меченый одноцепочечный ДНК- или РНК-зонд смешивают с двухцепочечной (клонированной, геномной или амплифицированной в ПЦР) ДНК смесь нагревают для разделения цепей. Происходит отжиг зонда с комплементарной ему цепью тестируемого фрагмента, при этом образуются гибридные дуплексы. Если в исследуемом образце имеется мутация, то в гибриде будет однонуклеотидный неспаренный участок. После отжига к смеси добавляют избыток одноцепочечной кольцевой ДНК, комплементарной зонду, для удаления его остатков. Проводят электрофорез смеси в денатурирующем градиентном геле. Гель высушивают и экспонируют с рентгеновской пленкой. Наличие неспаренных участков в мутантных образцах ДНК, изменяющих характер плавления, приводит к тому, что эти фрагменты оказываются в геле ближе к старту вследствие пониженной термостабильности. Преимущество такого метода разделения мо- чекул с неспаренными участками в его повышенной разрешающей способности.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)—это метод амплификации in vitro, с помощью которого в течение нескольких часов можно выделить и размножить определенную последовательность ДНК в количестве, превышающем исходное в 10 раз [1, 2]. Такая высокая степень направленного обогащения значительно упрощает использование имеющегося образца ДНК-Некоторые области применения ПЦР высокоэффективное клонирование геномных последовательностей [3], прямое секвени-рование митохондриальной и геномной ДНК [5—7, см. ниже], анализ вариаций нуклеотидных последовательностей [8] и выявление вирусных патогенов [9—И]. [c.176]

Классификация. Ее можно провести по разным признакам. По области использования различают 1) векторы общего назначения (клонирование геномных генов, кДНК, любых фрагментов ДНК), 2) векторы для экспрессии клонированных генов (синтез мРНК и белков) и 3) специализированные векторы (секвениро-вание и мутирование генов, изучение особенностей регуляции клонированных генов, идентификация в клонируемой ДНК про- [c.190]

Высокая консервативность гомеоблока проявляется не только при исследовании разных генов развития у дрозофилы. Перекрестная гибридизация с гено.мами червей, иглокожих и позвоночных, включая человека, выявила наличие нескольких фрагментов геномной ДНК, гибридизующихся с гомеоблоком дрозофилы. Если гены этих организмов, содержащие подобные последовательности, также вовлечены в регуляцию ключевых этапов развития, то гомеоблок дрозофилы может рассматриваться как способ их выявления и клонирования. Регуляторные механиз.мы, контролирующие развитие, могут оказаться более универсальными, чем ожидалось. [c.218]

Иммунологический скрининг В отсутствие ДНК-зонда для скрининга геномной библиотеки можно использовать другие методы. Например, если клонированный ген экспрессируется, то его продукт - весь белок или его часть - можно обнаружить иммунологиче- [c.67]

Векторные системы, способные интегрировать крупные вставки (>100 т. п. н.), имеют большую ценность при анализе сложных эукариотических геномов. Без таких векторов не обойтись, например, при картировании генома человека или при идентификации отдельных генов. В отличие от библиотек с небольшими вставками, в геномной библиотеке с крупными вставками скорее всего будет представлен весь генетический материал организма. Кроме того, в этом случае уменьшается число клонов, которые нужно поддерживать, и увеличивается вероятность того, что каждый из генов будет присутствовать в своем клоне. Для клонирования фрагментов ДНК размером от 100 до 300 т. п. н. был сконструирован низкокопийный плазмидный вектор на основе бактериофага Р1 — химерная конструкция, называемая искусственной хромосомой на основе фага Р1. Был создан также очень стабильный вектор, способный интегрировать вставки длиной от 150 до 300 т. п. н., на основе Р-плазмиды (F-фактора, или фактора фертильности) Е. соИ, которая представлена в клетке одной или двумя копиями, с селекционной системой la Z векторов pU . Эта конструк- [c.76]

Искусственные дрожжевые хромосомы (YA ) предназначены для клонирования больших фрагментов ДНК (100 т. п. н.), которые затем поддерживаются в дрожжевой клетке как отдельные хромосомы. УАС-система чрезвычайно стабильна. С ее помощью проводили физическое картирование геномной ДНК человека и анализ больших транскриптонов, создавали геномные библиотеки, содержащие ДНК индивидуальных хромосом человека. YA -вектор напоминает хромосому, поскольку он содержит последовательность, функционирующую как сайт инициации репликации ДНК (автономно реплицирующуюся последовательность), сегмент центромерной области дрожжевой хромосомы и последовательности, образующиеся на обоих концах при линеаризации ДНК и действующие как теломеры, обеспечивающие стабильность хромосомы (рис. 7.3). При встраивании чужеродной ДНК в YA может происходить нарушение рамки считывания маркерного дрожжевого гена. В результате продукт этого гена не образуется, и при выращивании клеток на специальной среде можно наблюдать цветную реакцию. Кроме того, некоторые YA -векгоры несут селективный маркер, независимый от сайта клонирования. Несмотря на все преимущества, YA пока не использовались для промышленного синтеза гетерологичных белков. [c.137]

Чтобы идентифицировать полиморфные STR-локусы, нужно прежде всего провести скрининг геномной библиотеки человека, содержащей вставки небольшого размера (примерно 1000 п. н.), используя подходящий олигонуклеотидный зонд. Для идентификации клонированных (СА),,-повторов обычно используют зонд, состоящий из 15 СА-элементов. Каждую позитивную вставку секвенируют, чтобы установить длину СА-повтора и нуклеотидные последовательности фланкирующих его участков. Чтобы определить, являются ли фланкирующие последовательности однокопийны- [c.454]

Геномная библиотека, банк (библиотека) генов (Genome lihrary) Набор клонированных фрагментов ДНК, в совокупности составляющих индивидуальный (групповой, видовой) геном. Если речь идет о крупном геноме (млекопитающие), то получают хромосомоспецифичные библиотеки. [c.546]

Отбирают яйцеклетки, переживших микроинъекцию ДНК, и вводят их в специальную микропипетку, с помощью которой привносят в яйцевод псевдобеременной мыши оплодотворенную яйцеклетку с включенной в нее клонированной ДНК. Часть пересаженных яиц погибает, а часть продолжает нормально развиваться. После этого естественным путем (или с помощью кесарева сечения) получают трансгенное потомство, идентифицируемое с помощью гибридизационного анализа высокомолекулярной геномной ДНК, изолированной из хвоста (отрезают кончик хвоста длиной примерно 1 см). [c.583]

Прямое выделение фрагментов генома, соответствующих зонду, сопряжено с практическими трудностями, и для выделения отдельных генов используют эффективный метод с обратным порядком стадий, когда вначале проводят клонирование генома. Затем проводят отбор клона(ов), содержащего специфическую последовательность. Векторы, несущие ДНК, полученную из генома, называют клонами геномной или хромосомной ДНК (в отличие от клонов кДНК, являющихся копиями мРНК). [c.243]

Как осуществляют селекцию определенного клона геномной ДНК из библиотеки Один из методов называется гибридизацией колоний. Последовательность операций этого метода приведена на рис. 19.8. Бактериальные колонии, несунще химерные векторы, лизируют на нитроцеллюлозных фильтрах. Затем их ДНК денатурируют и фиксируют на фильтре. Фильтр гибридизуют с радиоактивным зондом (обычно это клонированная кДНК), соответствующим интересующей исследователя последовательности. Все колонии, с которыми гибридизуется зонд, при авторадиографии выявляются в виде темных пятен. После этого соответствующие химерные векторы могут быть выделены из исходной библиотеки. [c.244]

Для гибридизации с зондом достаточно, чтобы клоны геномной ДНК содержали только часть комплементарной ему последовательности (обычно считают, что минимальный размер клонированной последовательности должен составлять около 50 п. н.). На практике, когда эукариотический ген имеет значительный размер, при создании библиотеки он может оказаться фрагментированным, так что разные участки гена окажутся в разных клонах, гибрвдизующихся с зондом. Полную нуклеотидную последовательность, соответствующую зонду, может не содержать ни один из клонов геномной ДНК. В этом случае необходимо реконструировать исходную геномную последовательность, используя наличие перекрываний индивидуальных фрагментов, которые, по всей видимости, имеют разные концы. [c.244]

Рестрикционное картирование как мРНК, так и геномной ДНК наиболее легко осуществить, используя клонированные последовательности. Разумеется, при ра- [c.248]

Смотреть страницы где упоминается термин Клонирование геномной ДНК: [c.122] [c.125] [c.125] [c.125] [c.277] [c.73] [c.219] [c.398] [c.172] [c.203] [c.245] [c.342] [c.173] [c.173] [c.218] [c.63] [c.89] [c.103] [c.462] [c.475] [c.562] [c.437] [c.194] [c.66] [c.248] [c.477] [c.504] [c.232]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология