Определение последовательности нуклеотидов в ДНК (секвенирование)

Рис. 5.3. Схема электрофореграммы, полученной с помощью химического метода секвенирования ДНК (первая снизу строка соответствует нуклеотиду на 5 -конце и является нуклеотидом Т на уровне первой дорожки. Для определения полной последовательности (отмечено пунктиром) проводят анализ послойно всех дорожек

Для определения последовательности нуклеотидов в ДНК было создано несколько методов. Во всех этих методах ферменты рестрикции используются для фиксации специфических точек отсчета . Последовательность нуклеотидов определяют в одноцепочечных фрагментах, состоящих из 100-200 нуклеотидов. Более длинные последовательности составляются из коротких фрагментов с частично перекрывающимися концами. При секвенировании комплементарной цепи проверяется правильность описания последовательности нуклеотидов в первой цепи. [c.273]

Все методы определения последовательности нуклеотидов основаны на создании исходного набора одноцепочечных фрагментов ДНК, начинающихся в определенной точке и оканчивающихся определенным нуклеотидом, тогда как размеры фрагментов могут быть различны. Каждый такой исходный набор фрагментов затем фракционируют по размерам посредством электрофореза в геле. Фрагменты должны быть помечены радиоактивным изотопом, для того чтобы их размер можно было определять путем радиоавтографии геля. Принципы секвенирования изображены схематически на рис. 9.8. [c.273]

Открытие возможности избирательной амплификации определенных участков ДНК с помощью полимеразной цепной реакции [Saiki et al., 1985, 1988] оказало чрезвычайно сильное влияние на всю молекулярную биологию, включая и секвенирование ДНК. До появления этого метода можно было секвенировать только рекомбинантные молекулы ДНК (кроме некоторых частных случаев). Причина этого кроется в низком содержании в геноме какой-либо определенной, даже повторяющейся, последовательности и невозможности детекции столь малого количества фрагментов ДНК при их секвенировании. Теоретически можно было бы детектировать на радиоавтографе секвенирующего геля полосы ДНК какого-нибудь условного гена, если взять в реакцию около 500 мг тотальной ДНК с ее концентрацией в реакционной смеси приблизительно 50 г/мл. Поскольку такое принципиально невозможно, то для определения последовательности нуклеотидов было необходимо использовать ДНК, обогащенную каким-либо геном или просто определенным участком, что и достигалось ранее посредством клонирования. В связи с достаточной сложностью методов клонирования получение таких рекомбинантных ДНК и их последующее секвенирование было доступно далеко не всем не молекулярно-биологическим лабораториям. Амплификация же определенных фрагментов ДНК с помощью специфических праймеров, приводящая за короткий промежуток времени к наработке значительных количеств нужных участков ДНК, явилась мощной и доступной альтернативой методу клонирования. Таким образом, многие лаборатории, ранее и не помышлявшие о секвенировании ДНК ввиду сложности подготовительных этапов, стали активно использовать этот метод в своих исследованиях. Поэтому можно смело предположить, что удельный вес ПЦР-секвенирования в общем определении нуклеотидных последовательностей различных ДНК будет несомненно возрастать. Что касается тех, кто и так раньше владел методами секвенирования ДНК, то они также взяли на вооружение метод ПЦР-секвениро-вания и занялись разработкой его различных модификаций, рассмотрению которых и будет посвящена данная глава. [c.134]

Определение последовательности нуклеотидов в ДНК (секвенирование) [c.273]

Секвенирование — определение последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК или последовательности аминокислот в молекуле белка. [c.357]

Секвенирование ДНК - определение последовательности нуклеотидов в ДНК. [c.125]

На рис. 1.1 в виде упрощенной схемы показан весь процесс определения последовательности нуклеотидов ДНК данным методом, из которого у читателя уже должно сложиться общее представление о секвенировании ДНК методом химической деградации, подробному рассмотрению которого и посвящены следующие разделы этой главы. [c.21]

Последовательность нуклеотидов и генетический код. Методы определения последовательности аминокислот в полипептидной цепи были известны еще в 50-х гг. Теоретически это относительно легкая проблема, поскольку все 20 аминокислот, встречающиеся в природных белках, имеют разные свойства. С другой стороны, нуклеотидная последовательность ДНК относительно однородна по составу элементарных звеньев, так как содержит только четыре типа азотистых оснований-гуанин, цитозин, аденин и тимин. Когда еще в 60-х г. был расшифрован генетический код, появилась возможность восстанавливать (дедуцировать) нуклеотидную последовательность транскрибируемой ДНК по аминокислотной последовательности соответствующего белка. Однако генетический код является вырожденным, то есть одной и той же аминокислоте соответствуют несколько разных нуклеотидных триплетов. Следовательно, суждения о нуклеотидной последовательности, основанные на последовательности аминокислот в белке, не однозначны. Кроме того, последовательности аминокислот не содержат никакой информации о последовательности некодирующих участков ДНК. В настоящее время разработаны методы непосредственного секвенирования ДНК [117]. Принцип состоит в следующем длинную молекулу ДНК фрагментируют при помощи агентов, расщепляющих ее в специфических сайтах. Затем определяют последовательность нуклеотидов в каждом из этих фрагментов. Очередность фрагментов в целой молекуле восстанавливают, используя перекрывающиеся концы идентичные цепи разрезают повторно другой рестриктазой, а затем последовательности перекрывающихся фрагментов, образующихся при обработке двумя рестриктазами разной специфичности, сравнивают. Так может быть реконструирована полная последовательность. В пределах отдельных фрагментов порядок нуклеотидов определяют с помощью специальных методов. Раньше секвенирование ДНК было весьма трудным делом, теперь же оно [c.131]

Следует подчеркнуть, что указанные количества ошибок при секвенировании ДНК могут быть присущи только первичному материалу в виде некой последовательности нуклеотидов, выявленной в процессе электрофореза и радиоавтографии. Однако точность определения нуклеотидной последовательности генов и прочих фрагментов ДНК должна составлять на заключительном этапе по крайней мере 99,95%, что достигается повторным (многократным) секвенированием данного фрагмента ДНК, да еще и по обеим цепям. Более строгим стандартом в последнее время считается 99,99%. Таким образом, завершенное секвенирование какого-либо фрагмента ДНК должно привести к последовательности нуклеотидов, допускающей только одну ошибку на 10 ООО нуклеотидов. [c.160]

Заключительным этапом анализа мутаций является их секвенирование, т. е. определение нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК, показавшего аномальную электрофоретическую подвижность. Последовательность нуклеотидов этого фрагмента сравнивается с нормой, в результате чего патология приобретает свою окончательную характеристику. [c.268]

В конце 70-х годов были разработаны методы для простого и быстрого определения последовательности нуклеотидов (секвенирования) любых очищенных фрагментов ДНК. Вслед за этим были определены полные последовательности нуклеотидов многих генов млекопитающих. включая гены, кодирующие гемоглобин, инсулин и цитохром с. Объем информации о последовательностях ДНК столь велик (многие миллионы нуклеотидов), что для хранения и анализа имеющихся данных необходимо использовать компьютеры. Секвенировано несколько протяженных последовательностей ДНК, содержащих более 10 пар нуклеотидов среди них полный геном вируса Эпщтейна-Барр (вызывающего у человека инфекционный мононуклеоз), а также полный геном хлоропластов растений. В настоящее время щироко используются два различных метода секвенирования ДНК принципы, лежащие в основе химического метода иллюстрированы рис. 4-66 и 4-67. ферментативный метод объясняется на рис. 4-68. [c.234]

Несмотря на то, что до точного картирования и секвенирования (определения последовательности нуклеотидов) каждого V-элемента генома мыши и человека еще далеко, у нас есть четкая картина строения Ig-генов в клетках зародышевой линии и в соматических клетках. На рис 4.5 приведена схема строения гена тяжелой цепи Ig, но очень похожие схемы можно нарисовать и для генов легких цепей Ig, и для ТкР-генов. Обратите внимание, что около ста V-генов (или V-элементов) расположено левее соединительных J-элементов (от англ. joining — J) и D-элементов (от англ. diversity — разнообразие), а они, в свою очередь, отделены от небольшого числа (примерно 8) генов константной области ( - onstant). D- и J-элементы кодируют [c.106]

Определение последовательности нуклеотидов рассмотренными выше методами предполагает разделение продуктов секвенирующих реакций (как полученных в ходе ферментативного секвенирования, так и в процессе химической деградации) с помощью высоковольтного секвенирующего электрофореза в полиакриламидном геле. Сразу следует отметить, что этот метод претерпел целый ряд всевозможных улучшений и модификаций, направленных, главным образом, на повышение его разрешающей способности, рассмотрение которых и будет основной темой данной главы, поскольку сам принцип электрофореза детально изложен во многих обзорах и целых книгах и рассматривать его здесь, видимо, будет излишним. [c.168]

При определении последовательности нуклеотидов протяженных фрагментов ДНК направленным подходом получение субклонов носит упорядоченный характер, иногда основанный на знании рестриктазной карты клонированного фрагмента ДНК, В связи с этим состыковка секвенированных фрагментов не представляет каких-либо сложностей, так как заранее известно, какое место вставки подвергается секвенированию. Уменьшается и общее число прочитанных нуклеотидов, что позволяет удешевить проект по секвенированию протяженного фрагмента ДНК. [c.248]

Главной целью любого секвенирования ДНК (как ручного, так и автоматического) является определение последовательности нуклеотидов исследуемого фрагмента ДНК. Как это проихсодит при ручном се- [c.323]

Рассматриваемые в гл. 8 стратегии секвенирования протяженных фрагментов ДНК ориентированы, в основном, на определение последовательности нуклеотидов в клонированных вставках длиною от 2 тпн до 45 тпн, что соответствует клонам в обычных плазмидных или космидных векторах. Однако простое переложение этих стратегий для секвенирования полных геномов невозможно, поскольку здесь должен действовать комплексный подход. Более того, учитывая большой объем предстоящей работы при секвенировании целых геномов организмов, должен соблюдаться некий баланс между производительностью выбранного метода, включая избыточность, получаемой с его помощью информации и стоимостью всего проекта. Это вместе с большими размерами геномов как бактерий, так и тем более высших организмов диктует свои особенности. Для последних считается, что усилия, прилагаемые на этапе картирования генома, должны соотноситься с тем количеством нуклеотидов, которые необходимо определить [Roa h et al., 1995]. [c.373]

В 1995 г. стали известны нуклеотидные последовательности двух прокариотических геномов. 1996 г. увеличил число таких геномов до 5 и добавил еще и один эукариотический геном. В 1997 г. было завершено секвенирование сразу 6 бактериальных геномов. Столько же новых геномов с определенной последовательностью нуклеотидов уже принес 1998 г. и в декабре предполагается завершение секвенирования генома еще одного эукариотического организма - нематоды aenorhabditis elegans. Можно ожидать, что в 1999 г. темпы расшифровки последовательности нуклеотидов полных геномов различных организмов еще увеличатся. Также не вызывает сомнений, что секвенирование полных геномов различных организмов станет важной задачей молекулярных биологов следующего столетия и продолжающееся бурными темпами развитие необходимой для этого техники (включая разработку новых подходов к секвенированию ДНК, создание соответствующих приборов, компьютерное обеспечение) сделает со временем подобные задачи весьма обычным делом, хотя и дорогостоящим. Пока же секвенирование геномов (особенно крупных) представляет собой трудную задачу, справиться с которой в обозримые сроки можно только при условии объединения усилий сразу нескольких исследовательских групп. В то же время, помимо непосредственного секвенирования полных геномов, все большее значение приобретает функциональная геномика, направленная на выяснение механизмов функционирования отдельных генов и их взаимодействия в составе целого организма. Именно в этом случае секвенирование геномов дает те сведения, которые от него ожидают, поскольку отдельные новые гены, которые становятся известны в результате секвенирования какого-либо полного генома, могли бы быть клонированы и секвенированы обычным путем и не они представляют собой главную цель подобных проектов. Но, учитывая огромный объем уже сейчас известной информации в виде последовательности нуклеотидов, можно представить, что пройдет еще много времени, пока станут детально известны особенности функционирования хоть какого-нибудь небольшого генома. [c.381]

Несмотря на ряд ограничений и низкую (пока) производительность рассматриваемых ниже методов, они имеют весьма важное преимущество. При секвенировании ДНК классическими способами определение последовательности нуклеотидов осуществляется путем разделения смеси гетерогенных фрагментов ДНК по их размеру с помощью электрофореза, но какого бы высокого разрешения он не проводился, все же эффективное разделение фрагментов ДНК крупнее 2000 нуклеотидов представляется маловероятным. А для секвенирования ДНК посредством синтеза теоретически предела чтения нуклеотидной последовательности секвенируемой матрицы ДНК не существует (разве что при достижении сверхвысокого количества новосинтезированной ДНК в реакционном сосуде) и поэтому, раз начавшись с какого-либо места протяженного фрагмента ДНК, его секвенирование может продолжаться бесконечно долго. Впрочем, в пиросеквенировании количество присоединяемых нуклеотидов зависит от местоположения биотинилированной метки, которая может быть как на 5 -, так и на З -конце ма- [c.388]

Многие компьютерные программы тех лет представляли собой небольшие программки для решения конкретных задач, вроде поиска сайтов рестрикционных эндонуклеаз, определения размеров получающихся фрагментов после расщепления ими молекул ДНК или определения молекулярной массы таких фрагментов, их нуклеотидного состава. С целью некоторого упорядочения информации обо всех этих программах и лучшей ориентации исследователей был подготовлен специальный указатель, вобравший в себя максимально возможное число известных к тому времени компьютерных программ и дающий краткое описание их возможностей [Rawling, 1986].Однако становилась очевидной насущная потребность создания так называемых пакетов прикладных программ, которые бы позволяли проводить целый ряд необходимых операций по всевозможному анализу секвенированных фрагментов ДНК, начиная от занесения последовательности нуклеотидов в компьютер до выявления особенностей кодируемых ими белков. [c.339]

Надо отметить относительную простоту процедур, требующихся для определения последовательности нуклеотидов ДНК данным методом, особенно по сравнению с секвенированием ДНК, основанным на полимеризации (метод Сэнгера) и деградации (метод Максама-Гилбер-та). Однако, к сожалению, существует ряд ограничений, из-за которых метод секвенирования ДНК гибридизацией так и не стал основным. Пожалуй, главными препятствиями этому служат серьезные проблемы при секвенировании повторяющихся элементов генома и чтение относительного малого числа нуклеотидов в ходе одного эксперимента. (Теоретически существующие возможности повышения разрешающей [c.400]

Таким образом, целая череда знаменательных событий в молекулярной биологии привела к долгожданной возможности определения последовательности нуклеотидов в молекулах ДНК. Получение с помогцью предложенных методов секвенирования ДНК совергпенно новых сведений в виде генетических текстов, ранее недоступных, оказало настолько значительное влияние на развитие не только самой молекулярной биологии, но и обгцей биологии и других смежных областей знаний, что заставило по-новому взглянуть на планирование и проведение экспериментов, на адекватность получаемых результатов поставленным задачам, вызвала к жизни разработку соответствуюгцего компьютерного обеспечения и пр. Словом, вся биологическая наука и связанные с ней дисциплины получили благодаря этим методам очень могцный импульс. Поэтому вполне оправданным выглядит решение Нобелевского комитета о присуждении в том же 1980 г. Нобелевской премии по химии У.Гилберту и Ф.Сэнгеру [c.15]

Методы секвенирования различаются в первую очередь по способу радиоактивного мечения, и кроме того по способу вьщеления исходного набора фрагментов. Представленная на рис. 9.8 схема основана на методе, разработанном Максамом и Гилбертом. Рестрикционный фрагмент метят радиоактивным изотопом Р в 5 -конце с использованием [у - Р] АТР и фермента, называемого полинуклеотидкиназа. Затем комплементарные цепи разделяют и в них независимо определяют последовательность нуклеотидов. На рис. 9.8 изображена одна цепь звездочка обозначает радиоактивную метку Р на 5 -конце. Четыре отдельных образца этого фрагмента подвергают действию различных реагентов, в результате чего образуется четыре исходных набора фрагментов различной величины. Фрагменты каждого из этих наборов на 5 -конце содержат радиоактивную метку, а на другом конце - определенный нуклеотид (см. рис. 9.8). (При этом образуются также наборы фрагментов с одинаковыми З -кон-цами, однако, эти фрагменты не попадают в поле зрения исследователя, поскольку не содержат радиоактивной метки). Затем четыре исходных набора фрагментов подвергают электрофорезу в полиакриламидном геле бок о бок . Положение каждого фрагмента в геле можно зафиксировать на обычной рентгеновской пленке. При этом обнаруживается набор полос, каждая из которых соответствует фрагменту определенного размера. Изображенная на рис. 9.8 последовательность фрагментов позволяет прямо с рентгеновской пленки считывать последовательность нуклеотидов, начиная с 5 -конца (т. е. снизу). На рис. 9.9 представлены реальные результаты радиоавтографии геля после электрофореза фрагментов. Как указывается в подписи к рисунку, в действительности нет необходимости в том, чтобы разрезание фрагментов исходного набора производилось по одному и тому же нуклеотиду. [c.273]

Другой подход к завершению определения нуклеотидной последовательности клонированного фрагмента ДНК заключается в целенаправленном субклонировании конкретного участка исходного клона. Достичь этого можно, построив с помощью компьютера рестриктазную карту секвенированных областей вставки, основываясь на ставшей уже известной последовательности нуклеотидов части секвенируемого фрагмента ДНК, что, возможно, позволит определить необходимые рестрикционные эндонуклеазы для субклонирования нужного фрагмента. [c.247]

Разработка быстрых методов секвенирования сделала возможным определение нуклеотидных последовательностей крупных молекул ДНК, а не только их фрагментов. В 1978 г Ф. Сэнгер с соавторами опубликовали первую полную последовательность геномной одноцепочечной ДНК бактериофага 0X174, имеющей размер 5386 нуклеотидов. Следующий рубеж был преодолен при определении нуклеотидной последовательности митохондриальной ДНК человека (16 569 пн) в 1981 г. Серьезным успехом явилось определение полной нуклеотидной последовательности ДНК бактериофага Я, состоящей из 48 502 пн. В 1992 г. С. Н. Щелкунов с соавторами вручную методом Максама-Гилберта секвенировали геном вируса натуральной оспы (186 тпн). До 1995 г. наиболее крупными геномами с известной последовательностью нуклеотидов были ДНК цитомегаловируса (229 тпн) и ДНК вируса осповакцины (192 тпн). [c.45]

Комбинируя клонирование в М13 и секвенирование с помощью дидезои и-терминатора, мы можем получить эффективный способ определения последовательностей молекул ДНК, длина которых достигает нескольких тысяч пар нуклеотидов. Для секвенирования длинных дуплексных молекул их разрезают механически на фрагменты и затем проводят клонирование. Каждая образующаяся блящка содержит определенные фрагменты или цепи. Случайно отбирая клоны, определяют последовательность вставок. Поскольку вставки образуются в результате разрыва исходной молекулы ДНК в случайных местах, некоторые фрагменты содержат перекрывающиеся последовательности. С помощью компьютера сравнивают последовательность каждого фрагмента с последовательностями других фрагментов (разд. 7.3), выявляют перекрывающиеся области и располагают отдельные фрагменты в определенном порядке. Таким способом были определены последовательности митохондриальной ДНК человека (16569 пар нуклеотидов) и ДНК Х-фага (48502 пары нуклеотидов). [c.326]

Смотреть страницы где упоминается термин Определение последовательности нуклеотидов в ДНК (секвенирование): [c.40] [c.40] [c.17] [c.109] [c.313] [c.401] [c.402] [c.403] [c.298] [c.283] [c.15] [c.59] [c.158] [c.176] [c.198] [c.246] [c.324] [c.329] [c.357] [c.357] [c.320] [c.28] [c.109]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология