Гель-электрофорез фрагментов ДНК

Вариабельность длины фрагментов ДНК, образующихся при ее расщеплении рестриктазами. Обусловлена мутационным изменением сайтов рестрикции или появлением новых сайтов. Обнаруживается при разделении фрагментов с помощью гель-электрофореза. [c.557]

Рис. 4.4. Картирование сайтов рестрикции. А. Результаты гель-электрофореза фрагментов ДНК, полученных ее расщеплением указанными ферментами. Очищенную ДНК гидролизовали рестриктазами ЕсоК и ВатШ раздельно, а затем их смесью, проводили гель-электрофорез и визуализировали продукты окращива-нием бромистым этидием. Числа слева от горизонтальных полос -длина фрагментов в парах оснований. Б. Рестрикционная карта, построенная по электрофоретическим данным. Числа - расстояние между сайтами узнавания соответствующих ферментов.

Одно из серьезных ограничений гель-электрофореза как метода выделения специфических фрагментов ДНК заключается в том, что молекулы, имеющие примерно одинаковую массу, но различную нуклеотидную последовательность, обладают, как правило, одинаковой электрофоретической подвижностью. Один из возможных подходов к решению этой проблемы основан на использовании предложенного в работе Фишера и Лермана [115] метода двумерного гель-электрофореза фрагментов ДНК. Сначала смесь фрагментов ДНК разделяют в соответствии с их размерами с помощью обычного гель-электрофореза, а затем в перпендикулярном направлении проводят электрофорез в 4%-ном полиакриламидном геле в градиенте концентрации формамида (от 4 до 30%) и мочевины (от 0,7 до 5,25 М). Разделение проводят при повышенной температуре. В этой методике использован эффект резкого уменьшения электрофоретической подвижности в результате денатурации или плавления части нативной молекулы ДНК. В ходе электрофореза во втором направлении фрагменты ДНК подвергаются воздействию все более жестких денатурирующих условий, и плавление части молекулы двухцепочечной ДНК сопровождается скачкообразным изменением ее подвижности. Связь между подвижностью фрагментов ДНК и их нуклеотидной последовательностью носит сложный характер и до сих пор окончательно не выяснена [115], [c.185]

В результате проведенного исследования авторы цитируемой работы пришли к заключению, что выявленные ими некоторые отличия в подвижности фрагментов ДНК зависят не только от их общей молекулярной массы и заряда, но и от весьма заметного взаимодействия различных нуклеотидов, находящихся на З -конце разделяемых гель-электрофорезом фрагментов ДНК. [c.184]

Широко применяемый для изучения биополимеров метод гель-электрофореза основан на различной подвижности макромолекул и их фрагментов в электрическом поле. Для разделения и исследования белков гель-электрофорез производится с додецилсульфатом натрия (ДСП), который связывается с молекулой белка, вызывая ее денатурацию. Подвижность молекулы в геле, на который наложено электрическое поле, зависит не только от заряда, но и от размеров молекулы (диффузионный эффект). [c.33]

Мы уже упоминали о методе гель-электрофореза (с. 33). Молекулы ДНК, несущие отрицательные заряды на фосфатных группах, перемещаются в электрическом поле на разные расстояния в зависимости от своих размеров. С помощью рестриктаз ДПК делится на ряд фрагментов, которые разделяются посред- [c.268]

Допустим, что выделенный образец ДНК содержит тождественные однонитевые фрагменты. Начала этих фрагментов метят, пришивая к ним " Р. Другой конец цепи не несет метки. Образец делят на четыре части. К первой из них добавляют вещество, рвущее нить вблизи аденина (А) с тем расчетом, чтобы в среднем в каждом фрагменте происходил один разрыв. Возникают уменьшенные субфрагменты разной длины, в том числе несущие метки Таким же способом определяют субфрагменты разрывами цепи вблизи Т, Г и Ц. Полученные четыре образца разделяют параллельно методом гель-электрофореза. После этого на гель накладывается фотопластинка, на которой отпечатываются те полоски в геле, которые несут радиоактивную метку. Схематически полученный результат показан на рис. 8.7. Последовательность непосредственно читается по электрофореграмме. В одном опыте удается прочесть текст длиною до 500 нуклеотидов. [c.269]

Если взять определенную молекулу ДНК и обработать ее подходящим рестриктирующим ферментом, то в строго определенных местах произойдут разрывы, которые разделят ДНК на ряд отдельных фрагментов. Эти фрагменты можно фракционировать по размеру методом гель-электрофореза. Для этого препарат разрезанной ДНК наносят сверху на агарозный гель. При наложении электрического поля фрагменты начнут перемещаться вниз по гелю со скоростью, зависящей от их длины. Чем короче фрагмент, тем быстрее он движется. (Пройденное расстояние обратно пропорционально логарифму длины фрагмента.) [c.44]

Обработка образца ДНК определенной рестриктазой всегда дает один и тот же набор фрагментов - при условии, что расщепление происходит по всем сайтам узнавания. Если использовать несколько ферментов рестрикции и сначала обработать ДНК каждой из рестриктаз в отдельности, а затем их комбинациями, можно построить физическую карту данной ДНК, т. е. установить порядок следования сайтов рестрикции вдоль молекулы. Определив размер полученных фрагментов с помощью гель-электрофореза, можно найти положение рестрикционных сайтов (дополнение 4.1). На рис. 4.4,А указаны размеры фрагментов, полученных в результате расщепления ДНК разными рестриктазами и их смесью. Из этих данных следует, что данный участок ДНК имеет по два сайта для ВатШ и ЕсоШ. [c.53]

Использование геля как среды, где проводится электрофорез, полностью устранило трудность, связанную с броуновским движением. Червеобразные молекулы ДНК, подобно угрям, запутавшимся в рыбацкой сети, оказываются фиксированными в полимерной сетке геля. Лишь под действием электрического поля они очень медленно ползут, извиваясь, к аноду, едва протискиваясь сквозь тесные ячейки сетки. Разрешающая способность метода гель-электрофореза оказалась настолько высокой, что не слишком длинные фрагменты ДНК, отличающиеся всего на одно мономерное звено, четко отделяются друг от друга в виде хорошо различимых полосок. [c.67]

Итак, с помощью рестриктаз можно нарезать ДНК на множество фрагментов. Метод гель-электрофореза позволяет выделить каждый фрагмент в изолированном виде. Это делается совсем просто — после выключения электрического поля гель разрезают обычным скальпелем на кусочки, чтобы каждый кусочек содержал одну полоску, одно скопление фрагментов ДНК строго определенной [c.67]

При гель-электрофорезе РНК в качестве денатурирующего агента обычно используют мочевину. РНК и ее фрагменты, в состав которых входит от 12 до 150 нуклеотидных звеньев, можно разделить в высокопроцентных полиакриламидных гелях, содержащих 7 М мочевину [85], а более длинные РНК (состоящие из 1500—4500 нуклеотидных звеньев)—в низкопроцентных полиакриламидных или агарозных гелях, содержащих 6 М мочевину [86, 87]. [c.179]

Гель-электрофорез использовали для изучения нуклеотидной последовательности ДНК генома до тех пор, пока не были открыты рестриктазы. К настоящему времени выделены сотни таких ферментов, каждый из которых узнает специфическую нуклеотидную последовательность длиной от 2 до 8 пар оснований и расщепляет двухцепочечную молекулу ДНК лишь в этом участке [108]. Точки расщепления обеих цепей ДНК могут находиться либо на одинаковом расстоянии от одного из концов молекулы (т. е. располагаться строго напротив друг друга), либо быть смещены относительно друг друга на несколько звеньев. В первом случае образуются фрагменты с тупыми концами, содержащие только спаренные нуклеотидные остатки, а во втором — с липкими , которые представляют собой небольшие участки одноцепочечной ДНК. Используя рестриктазы различной специфичности, можно расщепить высокомолекулярную ДНК на отдельные фрагменты, размеры большинства из которых находятся в диапазоне, приемлемом для разделения этих фрагментов с помощью электрофореза в полиакриламидном или агарозном геле [107]. Таким способом были получены уникальные фрагменты ДНК генома, которые затем были встроены в рекомбинантные ДНК-векторы [109]. Этот раздел посвящен разделению таких фрагментов. [c.184]

Эти олигонуклеотидные фрагменты разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, обладающего высокой разрешающей способностью [129, 135] (рис. 10.12). Чтобы исключить возможность образования внутримолекулярных вторичных структур (этот процесс особенно характерен для длинных олигонуклеотидов), в электродный буфер и в гель добавляют мочевину, выполняющую роль денатурирующего агента. При разработке этих систем гель-электрофореза было отмечено, что длина нуклеотидной последовательности, поддающейся прочтению непосредственно с помощью электрофореграммы, определяется разрешающей способностью метода электрофореза, которая в свою очередь зависит от толщины геля. В случае гелей толщиной 1—2 мм на радиоавтограмме обнаруживаются диффузные полосы, поскольку радиоактивный источник (фрагменты ДНК) весьма удален от поверхности рентгеновской пленки. Более тонкие гели (0,1—0,4 мм) позволяют достичь очень высокого разрешения олигонуклеотидов и обладают к тому же дополнительным преимуществом, которое заключается в том, что за счет тепла, выделяющегося в ходе электрофореза, происходит полная денатурация петель, обогащенных G -парами [129, 135]. [c.191]

Рис. 25.4. Гель-электрофорез, используемый для разделения фрагментов ДНК различной длины. Фрагменты образуются при разрезании ДНК одной или несколькими рестриктазами. Самые большие фрагменты движутся медленнее всех, так как им гораздо труднее пройти через поры в геле. На фотографии они расположены поблизости от стартовых лунок в геле.

Фрагменты разделяют по размерам с помощью гель-электрофореза в агарозном геле, как это было описано ранее (рис. 25.4). Фрагменты меньшего размера гораздо быстрее продвигаются к концу геля, чем большие фрагменты. [c.259]

Разделение фрагментов 8 по размерам с помощью 7 гель-электрофореза [c.267]

В качестве примера показан опыт, где полинуклеотид был разорван по остаткам О. Некоторые молекулы имели только один разрыв, другие — несколько. Однако в каждом случае один конец анализируемых молекул был помечен (показано звездочкой). Набор меченых фрагментов в условиях этого опыта состоял из молекул, размер которых соответствовал расстоянию от одного конца до каждого положения О в исходной ДНК. При разделении в электрофорезе фрагменты разной длины образуют полосы, положение которых в геле зависит от их длины. [c.50]

Распределение сайтов узнавания фермента носит случайный характер по отношению к геному в целом. Поэтому обработка эукариотической ДНК рестриктазами приводит к образованию множества фрагментов. При электрофорезе в геле эти фрагменты образуют пятно, в котором неразличимы отдельные полосы (за исключением ряда полос, соответствующих некоторым повторяющимся последовательностям, рассмотренным в гл. 24). [c.243]

И 5 -> 3, и 3 — 5 -экзонуклеазные активности ДНК-полимераз мешают проведению секвенирующих реакций и крайне нежелательны. Так, 3 -> 5 -экзонуклеазная редактирующая активность будет удалять только что включенные нуклеотиды, в том числе нуклеотиды с дидезо-ксирибозой (хотя и с меньшей скоростью), приводя в результате к неспецифической терминации растущих цепей ДНК и невозможности однозначного прочтения радиоавтографа геля. 5 —> З -экзонуклеазная активность может оказывать даже более серьезное отрицательное влияние на результаты секвенирования ДНК, заключающееся в удалении нуклеотидов на 5 -конце праймера, являющегося частью вновь синтезируемой цепи и приводя, таким образом, к образованию гетерогенных 5 -концов разделяемых гель-электрофорезом фрагментов ДНК. Результатом будет та же нечитаемая картина полос секвенируемой ДНК или даже полное ее отсутствие при использовании в качестве метки олигонуклеотидного праймера, меченного по 5 -концу. [c.80]

Для проведения секвенирующего гель-электрофореза фрагментов ДНК, кроме специально изготовленной камеры, которая может быть весьма простой и способной только поддерживать стекла с залитым между ними гелем, даже не обеспечивая при этом отвод выделяющегося в процессе электрофореза тепла, необходим высоковольтный источник питания. Для эффективного разделения в полиакриламидном секвенирующем геле фрагментов ДНК подаваемое напряжение должно быть в пределах от 30 до 50 В на см длины геля и, учитывая его большой размер, источник питания должен обеспечивать стабилизацию напряжения не менее 2000 В. Для более эффективного разделения фрагментов ДНК и повышения общей производительности метода можно порекомендовать приобретение фабрично изготовленного прибора, в котором предусмотрено и определенное удобство заливки геля и дальнейшего обращения с ним, и равномерное распределение Джоулева тепла во время электрофореза, и комплект запасных спейсеров и гребешков. Выбор подобных аппаратов, включая автоматические секвенаторы ДНК, достаточно велик, но и их стоимость весьма существенна. Однако следует отметить, что для осуществления небольших проектов секвенирования ДНК не обязательно приобретать дорогостоящие автоматические секвенаторы (хотя в последнее время появились относительно недорогие модели, о которых речь пойдет в главе, посвященной автоматическому секвенированию ДНК). [c.181]

В середине 1960-х годов начались исследования нуклеотидных последовательностей РНК. Первыми были определены первичные структуры тРНК (Р. Холли и сотр., 1965 А. А. Баев и сотр., 1967). Развитие техники фракционирования фрагментов нуклеиновых кислот и прежде всего гель-электрофореза (Ф. Сэнгер и сотр.) позволило в начале 1970-х годов приступить к изучению первичной структуры высокомолекулярных РНК. В 1976—1978 гг. были созданы исключительно быстрые и эффективные методы секвени-рования ДНК и РНК (А. Максам и У. Гилберт, Ф. Сэнгер и сотр.), которые позволили за короткое время получить огромную информацию о первичной структуре генов, их регуляторных элементах, вирусных и рибосомных РНК и т. д. [c.7]

Длины фрагментов определяют с помощью высокоразрешающего электрофореза в тонком слое пшиакриламидного геля. Электрофорез проводится при повышенной температуре в буферной систе.ме, содержащей 7 М мочевину, что способствует разрушению вторичной структуры фрагментов детекция зон фрагментов на электрофореграмме зависит от способа мечения его конца (если это [c.16]

Рассмотренные выше факты привели к концепции, предполагающей, что ( а++К+)-зависимая АТРаза и является, по существу, мембранным ионным нашсом. Для активации фер ментной системы ионы К+ и №+ должны находиться по разные стороны от мембраны. Вместе с тем очищенный фермент должен гидролизовать АТР в пробирке в присутствии Na++K++Mg2+. Этот бетокудалосьвыделитьвочищенном виде [53—56]. При гель-электрофорезе в присутствии додецилсульфата натрия очищенная (На++К+)-зависимая АТРаза разделяется на две субъединицы. Большая из них представляет собой полипептидную цепь с мол. весом - 95 000—100 000, а меньшая является гликопротеидом с мол. весом 50 000. Антитела к изолированной большой субъединице связываются с фрагментами мембран, принадлежащими, по-видимому, участкам внутренней поверхности плазматической мембраны [57]. Логично предположить, что гликопротеидная субъединица фермента расположена на наружной поверхности мембраны. [c.362]

Ялюс -процедура включает экзонуклеолитическое расщепление синтетических фрагментов ДНК путем удаления одного за другим оснований с З -конца. Эта процедура требует применения модифицированной ДНК-полимеразы I, которую можно останавливать в определенных положениях разрушаемой последовательности добавлением одного из четырех нуклеозидтрифосфатов. Снова, проводя параллельно четыре реакции, каждая из которых наращивает один нуклеотид (+А, +С, -fG или -f-T), расщепление может быть остановлено перед одним из оснований (А, С, G или Т). Снова гель-электрофорез дает картину ряда полос, с которой можно непосредственно считывать последовательность. Эта методология иллюстрируется рис. 22.4.2. [c.189]

Очень часто для решения биотехнологических и некоторых других задач бывает необходимо знать полную нуклеотидную последовательность клонированного гена. Для секвенирования используют несколько методов один из них - ди-дезокси-метод, разработанный Сангером и др. В его основе лежит остановка синтеза цепи после присоединения к ней дидезоксинуклеотида. У такого нуклеотида отсутствует 3 "-гидроксильная группа, и дальнейший рост цепи становится невозможным. Для секвенирования в разных пробирках одновременно проводят четыре реакции синтеза ДНК, каждая - в присутствии одного из четырех дидезоксинуклеотидов. Продукты реакций разделяют с помощью гель-электрофореза, проводят радиоавтографию и считывают с радиоавтографа нуклеотидную последовательность синтезированного фрагмента ДНК. [c.103]

Двумерный электрофорез в полиакриламидном геле может быть также использован для локализации участков ДНК, отвечающих 5 - и З -концевым последовательностям и точкам внут-)имолекулярного переплетения ядерной или вирусной РНК 116]. С этой целью продукт гибридизации РНК и ДНК обрабатывают эндонуклеазой S1, специфичной по отношению к одноцепочечным нуклеиновым кислотам, и полученные гибриды комплементарных фрагментов ДНК и РНК разделяют в соответствии с их размерами с помощью гель-электрофореза. Затем в денатурирующих условиях проводят электрофорез во втором направлении, с тем чтобы определить размер образующихся одноцепочечных фрагментов ДНК. Специфические последовательности обнаруживают с помощью блоттинга по Саузерну и последующей молекулярной гибридизации [116]. Одноцепочечные фрагменты ДНК можно легко разделить с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в щелочной среде. Денатурированные образцы подвергают гель-электрофорезу в буфере, содержащем 30 мМ NaOH и 2 мМ ЭДТА [117]. По своему поведению в этих условиях электрофореза такие фрагменты похожи на одноцепочечные фрагменты РНК (разд. 10.5.2). [c.187]

Используя праймеры, фланкирующие сайт vnl, амплифицируют с помощью ПЦР небольшое количество тестируемой ДНК (рис. 9.9, А). Амплифицированный фрагмент обрабатывают vnl, продукты рестрикции разделяют с помощью гель-электрофореза и окрашивают их бромистым этидием. При наличии vnl-сайта на электрофореграмме появляется специфический набор полос (рис. 9.9, В), отличный от такового [c.195]

Рис. 19.6. Идентификация клеток, несущих трансген в специфическом сайте, при помощи ПЦР. А. В результате неспецифического встраивания векторной ДНК один из праймеров (Р2) не сможет гибридизоваться с участком хромосомы, находящимся на определенном расстоянии от места отжига праймера Р1, и фрагмента нужного размера при амплификации не образуется. Р1 гибридизуется с уникальным участком (118) встроенной ДНК, отсутствующим в хромосомной ДНК клетки-реципиента. Б. В результате гомологичной рекомбинации между участками НВ1 и НВ2 встраиваемой ДНК, с одной стороны, и комплементарными участками хромосомы С81 и С82, с другой, образуются участки, с которыми могут гибридизоваться оба праймера, Р1 и Р2, и которые находятся на определенном расстоянии друг от друга. В ходе ПЦР-амплификации синтезируются фрагменты одного размера, которые можно идентифицировать при помощи гель-электрофореза. Если ПЦР-продукт нужной длины образовался, значит трансген (ТО), находящийся между гомологичными участками (НВ1 и НВ2), встроился в определенный сайт хромосомы.

Отпечаток пальцев (DNA fingerprint) Набор рестрикционных фрагментов ДНК, характерный для данного индивидуума. Для получения отпечатка используют либо гель-электрофорез как таковой, либо в сочетании с ПЦР-амплификацией. [c.555]

Наряду с химической модификацией для тех же целей люжно использовать ферменты, катализирующие гидролиз нуг<лсиноных кислот. Например, в экспериментах по футпринтингу комплексов ДНК с белками часто используют панкреатическую дезоксирибонуклеазу (ДНКаза I), которая выделяется в пищеварительный тракт млекопитающих поджелудочной яселезой. Этот фермент катализируе г гидролиз внутренних фосфодиэфирных связей в двунитевых и однонитевых ДНК. При кратковременной обработке ДНК этим ферментом, проведенной так, чтобы в среднем на каждую молекулу ДНК пришелся одш разрыв, расщепление приводит к образованию фрагментов самой разнообразной длины, легко регистрируемых с помощью гель-электрофореза. При такой же обработке комплекса ДНК с белком расщепления в участках, экранирован 1ых белковой молекулой, не происходит и фрагменты соответствующей длины на электрофореграмме не обнаруживаются. На рис. 94 в качестве примера приведен результат исследования с помощью футпринтинга фрагмента ДНК с ферментом РНК-полимеразой (см. [c.324]

Для фракционирования олигорибонуклеотидов может быть также использован двумерный гель-электрофорез [127]. В ходе первой стадии электрофореза, которую проводят в 0,025 М лимонной кислоте, содержащей 6 М мочевину, происходит разделение олигомеров в соответствии с их размерами и нуклеотидным составом, а вторая стадия представляет собой обычный электрофорез при pH 8 [127].С помощью этого метода можно разделить олигомеры длиной до 80 нуклеотидных остатков. Путем сравнения картин распределения пятен ( отпечатков пальцев ), отвечающих разделенным с помощью двумерного электрофореза [и (или) гомохроматографии] олигорибонуклеотидам двух РНК, нуклеотидная последовательность одной из которых известна, можно оценить степень структурной гомологии этих РНК, а затем отобрать для дальнейшего анализа лишь такие олигорибонуклеотиды второй РНК, которые по подвижности не совпада-чют ни с одним из фрагментов РНК с известной структурой (рис. 10.11). [c.190]

Б — электрофорез фрагментов ДНК, полученных путем расщепления хроматина эритроцитов цыпленка с помощью ДНКазы I, в пластинке 10%-ного полиакриламидного геля содержащего 40 мМ трис, 20 мМ NaOA , 2 мМ ЭДТА и 7М мочевину (pH 7,8). Ступенчатый характер полученной картины разделения обусловлен те.ч, что ДНКаза I расщепляет нуклеосомальную ДНК на фрагменты, различающиеся по длине на 10 нуклеотидных пар. (Дж. Аллан, неопубликованные результаты.) [c.194]

Недавно было показано, что нуклеопротеиды [147] и другие белки [148], разделенные с помощью гель-электрофореза, можно перенести на нитроцеллюлозные или диазобензилоксиметилцел-люлозные фильтры. Более того, белки после такой процедуры сохраняют способность связываться с ДНК [148]. С помощью этого метода, по-видимому, можно выделить и охарактеризовать белки, взаимодействующие с ДНК или РНК. В работе [149] показано, что /ас-репрессор из Е. соИ специфически удерживается на колонке с диазобензилоксиметилцеллюлозой, содержащей ковалентно связанные фрагменты /ас-оператора Е. соН. В отличие от электрофоретического разделения, которое требует соблюдения весьма специфических условий, этот тип аффинной хроматографии идеально подходит для изучения влияния ионной силы, pH и температуры на эффективность взаимодействия белков с нуклеиновыми кислотами. Такого рода аффинную хроматографию, вероятно, можно использовать для очистки белков, контролирующих экспрессию генов. [c.196]

Быстрое распространение хроматографических и электрофоретических методов в области исследования нуклеиновых кислот, которому в значительной степени способствовало становление технологии рекомбинантных ДНК, продолжается и по сей день, особенно в таких направлениях, как разделение мРНК, фрагментов ДНК и нуклеопротеидов. Уже установлена первичная структура обширных участков генома многих животных, и непрерывное совершенствование метода гель-электрофореза, обладающего высоким разрешением, в сочетании с использованием компьютерной техники для определения полных нуклеотидных последовательностей позволит добиться еще более значительных успехов. На ранних этапах развития этой области исследований одна из задач экспериментатора заключалась в том, чтобы приспособить используемые в других областях науки хроматографические и электрофоретические методы для разделения моно- и олигонуклеотидов. Теперь же, по прошествии тридцати лет, биохимия нуклеиновых кислот сама стала тем источником новых представлений о разделении макромолекул, который стимулирует развитие хроматографии и электрофореза. [c.196]

Известно, что каждый нуклеотид в ДНК несет фосфатную группу, которая заряжена отрицательно, поэтому фрагменты ДНК различной длины заряжены неодинаково. Эти различия можно использовать для разделения фрагментов ДНК в электрическом поле методом гель-электрофореза (рис. 25.4). Как следует из названия метода, он предполагает использование агарозного (для очень больших фрагментов) или полиакриламидного (для фрагментов меньших размеров) геля. Поскольку ДНК бесцветна, положение того или иного фрагмента в геле после электрофореза выявляют либо с помошью окращивания, либо используя радиоактивно меченную ДНК и проводя радиоавтографию, в ходе которой на гель накладывают фотографическую пленку. Радиоактивное излучение засвечивает пленку в том месте, где расположена ДНК. [c.219]

Электрофорез в геле идентификация фрагментов путем гибридизации с кДНК [c.252]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология