Антитела против галактозидазы

На колонку, содержащую 5 мг -галактозидазы или 5 мл смолы, сшитой с гибридным белком (табл. 5.6), нанесите 10—20 мл антисыворотки. Проводите элюцию PBS и промывайте колонку буфером BBS-твин ) до тех пор, пока с нее не перестанет сходить белок. Уравновесьте колонку PBS. Для обеспечения наиболее полной элюции элюируйте связавшиеся антитела 4 М гуанидинхлоридом. Диализуйте собранный пик против 100 объемов PBS ) как минимум три раза, диализуя раствор против каждой смены буфера не менее трех часов. Снова уравновесьте колонку 3—5 объемами PBS. [c.167]

Чтобы выяснить, можно ли осуществить конкурентный им муноанализ, -инкубировали образцы сыворотки, содержащие ферритин, с антиферритином и ферритином, связанным с ферментом, затем добавляли субстрат и антитела против IgG козы. Полученные результаты (рис. 8-10) показывают, что чувствительность метода достаточна для количественного определения тех концентраций ферритина, с которыми сталкиваются в клинике (10—500 нг/мл). Тем не менее при анализе многих образцов сыворотки, содержащих ингибитор -галактозидазы, возникают серьезные трудности. Показано, что в некоторых случаях ингибитором служат антитела против -галактозидазы, подавляющие активность за счет перекрывания доступа высокомолекулярного субстрата к ферменту. [c.111]

Еще более убедительны опыты, демонстрирующие приобретение растущим пептидом на рибосоме иммунологической специфичности, присущей нативной конформации готового белка. Так, рибосомы, несущие растущие цепи р-галактозидазы, реагируют с антителами против готового фермента еще задолго до завершения трансляции мРНК и освобождения белка. Используемые антитела были специфичны к третичной структуре денатурация рибосомосвязанного материала путем нагревания полностью разрушала его способность реагировать с антителами. [c.273]

Для определения количества специфичных к гибридному белку антител, присутствующих в сыворотке, и для получения препарата антител, не загрязненного антителами к -галактозидазе, антисыворотку к гибридному белку сначала наносят на аффинную колонку, содержащую иммобилизованную -галактозидазу. Для подготовки такой колонки используют 5—7 мг очищенной -галактозидазы Е. oli (Sigma) диализованной против PBS. Метод подробно приводится в табл. 5.6. [c.165]

Синтез конъюгата кроличьих антител против IgG-овцы с p-D-галактозидазой с помощью SIAB. [c.188]

Рис. 8-7. Турбидиметрический иммунный анализ С-реактивного белка в сыворотке человека, основанный на активации фермента. Антитела против С-реактнв-ного белка, меченные с помощью 2 мкг -галактозидазы, инкубировали с С-ре-

Так же как в колориметрическом иммуноанализе на основе ингибирования, антиген метили ферментом. К каждой молекуле ферритина присоединялись три молекулы -галактозидазы. Активность конъюгата по расщеплению высокомолекулярного флуорогенного субстрата подавлялась при инкубации с анти-ферритином — антителами козы против ферритина (рис. 8-9). При насыщающих концентрациях антител ингибирование достигало 50%. Добавление вместе с субстратом избытка антител против IgG козы сильно увеличивало ингибирование ненасыщающими концентрациями антиферритина (рис. 8-9). Однако [c.110]

В случае ИФА кортизола для конъюгации гаптена с сульфгидрильными группами -галактозидазы были синтезированы производные кортизола — КГС-МБ и К-МБ. С целью сравнения нашего метода конъюгации с разработанными ранее мы проводили также связывание КГС с аминогруппами -ra-лактозидазы методом смешанных ангидридов. Сравнение полученных конъюгатов проводили методом осаждения вторыми антителами при избытке антител против кортизола. Установлено, что при использовании метода смешанных ангидридов метится только 40% молекул фермента, при этом ферментативная активность снижается на 20%. При использовании разработанного нами метода конъюгации с производными гаптена без заметного снижения ферментативной активности метится более 95% фермента (табл. 17-1). Число молей КГС-МБ или К-МБ, связанных с ферментом, непосредственно не определяли. Однако, как и в случае конъюгата [Т4 — фермент], можно счн тать, что с каждой. молекулой -галактозидазы связывается до 12 молекул гаптена. Изучали также иммунологическую активность и специфичность взаимодействия конъюгатов [гаптен — фермент] с антисывороткой против кортизола. Конъюгаты типа [КГС— ,-гaлaктoзидaзa] и [КГС-МБ— -гаЛактозидаза] обладают высокой иммунологической активностью, но лишь в незначительной степени вытесняются из комплекса с антителами [c.271]

Чтобы проверить, действительно ли р-галактозидаза высвобождается в результате отщепления убикитина от образовавшегося гибридного белка, вы выделяете с помощью антител нерадиоактивную р-галактозидазу из клеток, содержащих те же три плазмиды. Затем вы подвергаете эти образцы гель-электрофорезу с ДСН, переносите пластины геля на фильтровальную бумагу и проводите реакцию взаимодействия с радиоактивными антителами против убикитина. Как видно из рис. 8-3, антитела к убикитину не взаимодействовали с материалом, соответствующим полосе р-галактозидазы. Однако эти антитела взаимодействовали со всеми полосами, расположенными над р-галактозидазой. Рас- [c.103]

A. Отсутствие радиоактивности в полосе р-галактозидазы указывает на то, что антитела против убикитина не связались. Таким образом, полоса, отмеченная на рис. 8-2, А как р-галактозидаза, не содержит связанного убикитина, т. е. с N-конца гибридного белка он действительно удален. [c.364]

Рис. 8-9. Ингибирующее действие антиферритииа на ферритин, меченный -галактозидазой. -Галактозидазу (1 нг), связанную с ферритином, инкубировали 2,5 ч с антителами козы против ферритина в 0,2 мл буфера при комнатной температуре. Для измерения ферментативной активности прибавляли 0,7 мл раствора, содержащего 40 нмоль высокомолекулярного флуорогенного субстрата с. добавкой (темные кружки) или без добавки (светлые кружки)

Справочник химика 21

Химия и химическая технология