Белок иммунный анализ

Одно из самых значительных достижений рентгеноструктурного анализа белков последних лет, которое не может не повлиять на дальнейшее развитие биологии и становление ее новой области -молекулярной биологии клетки, состоит в начавшейся расшифровке трехмерных структур первых мембранных белков. Перед обсуждением полученных здесь результатов целесообразно кратко сообщить о том, что было известно об этих белках до исследования их с помощью рентгеновской дифракции. Если основные структурные особенности биологических мембран определяются молекулами липидного бислоя, то специфические функции мембран выполняются главным образом белками. Они ответственны за процессы превращения энергии, выступают в качестве рецепторов и ферментов, образуют каналы активного и пассивного транспорта молекул и ионов различных веществ через мембраны, охраняют организм от проникновения чужеродных антигенов и стимулируют иммунный ответ клеточного типа. В обычной плазматической мембране белок составляет около 50% ее массы. Однако в некоторых мембранах, например во внутренних мембранах митохондрий и хлоропластов, его содержание поднимается до 75%, а в других, например миелиновой мембране, снижается до 25%. Многие мембранные белки пронизывают липидный бислой насквозь и контактируют с водной средой по обеим сторонам мембраны. Молекулы этих белков, называемых трансмембранными, как и окружающие их молекулы липидов, обладают амфипатическими свойствами, поскольку содержат гидрофобные участки, взаимодействующие внутри бислоя с гидрофобными хвостами липидов, и гидрофильные участки, обращенные к воде с обеих сторон мембраны. Другая группа мембранных белков соприкасается с водой только с одной стороны бислоя [234, 235]. Одни из них погружены только во внешний или во внутренний слой мембраны, другие ассоциированы за счет невалентных взаимодействий с трансмембранными белками, третьи прикреплены к мембране с помощью ковалентно связанных с ними цепей жирных кислот, внедренных в липидный слой. [c.56]

Поверхностная иммобилизация может вызывать изменение конфигурации белка и в связи с этим изменение кинетики иммунного анализа. [c.574]

В твердофазном иммунном анализе твердая фаза играет роль несущей подложки . Ее, однако, нельзя рассматривать как пассивный компонент. Можно использовать и химическую, и физическую адсорбцию антитела или антигена, хотя большинство иммунных определений основано на физической, нековалентной адсорбции. Как обсуждалось в разд. 7.8, даже физическая адсорбция представляет собой недостаточно изученный процесс. Связывание белков, по-видимому, имеет гидрофобную природу, и все же в естественной конфигурации белков в водном растворе гидрофильные группы стремятся расположиться на поверхности, а гидрофобные группы — внутри полимера. Следовательно, связывание с гидрофобными поверхностями неизбежно вызывает изменение кон- [c.574]

Все белки, изученные до сих пор, обладают антигенными св-вами. У белков различают линейные детерминанты, построенные из аминокислотных остатков, расположенных рядом в одном участке полипептидной цепи, и конформационные, к-рые слагаются из аминокислотных остатков разных участков одной или большего числа полипептидных цепей. Антитела, полученные при иммунизации данного животного определенным белком, могут реагировать, хотя и с небольшим сродством, с нек-рыми пептидами, выделенными из гидролизата зтого белка. Такие пептиды, построенные из 5-7 остатков, часто располагаются на изгибах или выступающих отрезках пептидной цепи и, очевидно, являются детерминантами или их частями. Однако в иных условиях, напр, при иммунизации др. вида животного, могут образовываться антитела к иным участкам молекулы того же белкового А. Практически вся пов-сть белковых молекул обладает антигенными св-вами, она, т. обр., представляет собой сумму перекрывающихся детерминант, каждая из к-рых может вызывать иммунную р-цию или не вызывать ее в конкретных условиях. Последние определяются различиями в строении между белковым А, и собственными белками организма, а также регуляторными иммунными механизмами, находящимися под генетич. контролем. По-видимому, почти все детерминанты белков конформационно зависимы. Согласно данным рентгеноструктурного анализа, антигенные детерминанты обладают повыш. подвижностью. [c.174]

Иммунные сыворотки, которые готовят для иммунохимического анализа белков, должны преципитировать соответствующие белковые антигены, разведенные не менее чем в соотношении [c.122]

Рис. 8-7. Турбидиметрический иммунный анализ С-реактивного белка в сыворотке человека, основанный на активации фермента. Антитела против С-реактнв-ного белка, меченные с помощью 2 мкг -галактозидазы, инкубировали с С-ре-

Буферный раствор Михаэлиса очень удобен для иммуно-электрофоретического анализа белков сыворотки крови. Однако можно использовать и другие буферные растворы. В этих случаях, разумеется, следует готовить агаровый гель на том же буферном растворе, в котором проводится электрофорез. [c.140]

Биохимия не только использует в своих целях методы, созданные в рамках других химических дисциплин, но и вооружает химию новыми методами, основанными на применении биополимеров как инструмента химического исследования. Ферменты часто позволяют с уникальной, недоступной обычным химическим приемам избирательностью провести анализ сложных реакционных смесей, осуществить химические превращения в мягких условиях, избегая побочных реакций и побочных продуктов. Большое значение для решения тонких аналитических задач приобрели иммунохимические методы, использующие в качестве инструмента анализа антитела — белки, вырабатываемые высшими живыми организмами в ответ на введение чужеродных веществ. Антитела обладают способностью избирательно взаимодействовать именно с этими, вызвавшими иммунный ответ веществами и могут поэтому использоваться для их определения в сложных смесях. [c.10]

Перед использованием аффинного сорбента рекомендуется отмыть его от 0,02%-ного азида натрия, который обычно добавляется в коммерческие препараты для предотвращения биодеградации носителя. Примеси белков или свободного лиганда удаляют кратковременной промывкой 1 М раствором уксусной кислоты с последующей тщательной промывкой обычным нейтральным буферным раствором. Перед нанесением образца на колонку необходимо определить специфическую активность исследуемого белка. Концентрацию белка целесообразно определять с помощью иммунохимического метода, например иммуно-ферментным или радиоиммунным анализом. [c.185]

Для того чтобы узнать, заражен ли человек ВИЧ, необходимо сделать анализ крови. Известно, что иммунная система реагирует на внедрение патогенов выработкой антител. Образец проверяемой крови смешивают с производимыми сейчас в коммерческих масштабах белками ВИЧ. Если в крови присутствуют антитела против этого вируса, реакция оказывается положительной, а пациента, прошедшего тестирование, называют ВИЧ-положительным. Однако даже при отрицательном результате инфекция не исключена, поскольку достаточное для выявления стандартным методом количество антител иногда накапливается в крови только через три месяца после заражения, а то и позже. [c.216]

Несмотря на то, что белки клеточной иммунной системы являются мембранными белками, тем не менее, принимая во внимание их функциональные особенности, целесообразно рассмотреть последние достижения рентгеноструктурного анализа в изучении их пространственного строения в отдельном разделе. [c.66]

К представленному выше материалу о Т-лимфоцитах кристаллография белков прямого отношения не имела. В значительной мере поэтому почти все то, что было сказано о функционировании Т-клеток, молекулярных структурах поверхностных белков и их комплексов, природе и побудительных мотивах антитело-антигенных взаимодействий, работе сигнальных систем и регуляторных механизмов носит общий, феноменологический и предположительный характер. Рентгеновские данные о трехмерных структурах мембранных белков и их отдельных доменов, участвующих в функционировании Т-клеточной иммунной системы, начали появляться лишь в 1990-х годах. Поскольку речь идет главным образом о структурах мембранных белков, то использование метода рентгеновской дифракции в клеточной иммунологии сталкивается с большими препаративными трудностями, не в полной мере еще преодоленными. Впрочем, аналогичная ситуация и во всех других направлениях молекулярной биологии, имеющих дело с изучением явлений, протекающих на поверхности клеток. Поэтому при оценке обсуждаемых ниже конкретных результатов рентгеноструктурного анализа следует учитывать, что они означают только обнадеживающее начало широкого проникновения метода в проблематику Т-клеточной иммунологии. [c.70]

Дифференцировка лимфоцитов осуществляется в два этапа во время эмбриогенеза и во взрослом состоянии, при развитии иммунного про цесса. Эти возможности обусловлены исключительным разнообразием белков, синте ируемых разными лимфатическими клетками, хорошей изученностью строения этих белков и возможностью их точной идентификации. Именно успехи в этой области заложили основы для глубокого и последовательного анализа дифференцировки лимфатических кле ток. Это представляет особый интерес для специалистов в области био логин развития. [c.3]

РНП, и полипептиды, общие для нескольких разных РНП. Это показано с помощью иммунного анализа с использованием сыворотки пациентов с некоторыми видами красной волчанки, у которых вырабатываются антитела к белкам мяРНП. [c.222]

Конечной целью медико-генетических исследований является создание методов лечения всех наследственных заболеваний. В табл. 21.1 перечислены продукты некоторых генов, коротко описаны симптомы заболеваний, которые обусловливаются мутациями в этих генах, указаны способы их лечения. Наследственные заболевания имеют сложные клинические проявления, и их лечение носит во многом симптоматический характер. Некоторые нарушения метаболизма корректируют назначением специальной диеты, что приводит к снижению уровня токсичных веществ в организме, накопление которых обусловливается мутациями в определенных генах. Так, при фенилкетонурии, которую выявляют у новорожденных с помощью специфического биохимического анализа крови, назначают безаланиновую диету. Для облегчения симптомов наследственных заболеваний, связанных с дефектом определенного белка, вводят внутривенно его функциональную форму, не вызывающую иммунной реакции. Такую заместительную терапию используют, например, ддя лечения гемофилии, тяжелого комбиниро- [c.483]

Наиболее простой способ исследования растворимых антигенов в реакции преципитации заключается в том, что исследуемый раствор смешивают со специфической иммунной сывороткой, а затем наблюдают образование преципитата. Эта реакция применяется главным образом для определения титров. Только в том случае, когда реакция ставится с иммунной сывороткой, специфичной к данному белку, величина титра может служить характеристикой белкового препарата. Действительно широкое применение имму-нохимического подхода к анализу белков началось только после того, как появились иммунодиффузионные методы исследования. [c.18]

Число линий преципитации на электрофореграмме зависит от используемой иммунной сыворотки. Например, хорошо себя зарекомендовавшая кроличья антисыворотка к белкам сыворотки человека фирмы Behringwerke (ФРГ) и аналогичная лошадиная антисыворотка института Human (Венгерская Народная Республика) позволяют идентифицировать примерно 20 белковых фракций сыворотки. Принципиальная возможность приготовления антисыворотки практически к любому белку значительно увеличивает применимость иммуноэлектрофореза. Кроме того, приготовив антисыворотки, специфичные к какому-либо одному-единственному белку (или небольшому числу белков), можно в смеси белков исследовать составляющие ее отдельные компоненты. Иммунные сыворотки, предназначенные для иммунохимического анализа отдельных белков плазмы человека, уже имеются в продаже. [c.21]

Для успешного анализа белковых растворов неизвестного состава можно применять следующие методы 1) иммуноэлектрофорез в тех случаях, когда удается идентифицировать полосы преципитации, полученные с иммунной сывороткой (фиг., 31,у4) 2) метод Оссермана в тех случаях, когда исследователь располагает растворами референс-белка и соответствующей антисывороткой (фиг. 31, В) 3) метод так называемого истощения (фиг. 31, ), который вкратце заключается в следующем. [c.150]

В качестве антигена во всех исследованиях, за исключением одного, применялась противобрюшнотифозная вакцина. Такая однотипность опытов позволила провести сравнительный анализ. Оказалось, что большинство испытанных профессиональных ядов вызывало угнетение продукции иммунных антител только при длительном отравлении. Они не изменяли или почти не изменяли первичного ответа, т. е. не влияли на процесс индукции антителогенеза. Существенное снижение титров наблюдалось лишь после ревакцинации, проведенной на более поздних этапах хронического отравления ртутью, анилином, нитробензолом, дихлорэтаном, окисью углерода, бензином (В. К. Навроцкий, 1960 И. М. Трахтенберг, 1964 Г. М. Мухаметова, 1966). При отравлении гамма-изомеро.м гексахлорциклогексана снижение титров было значительным только перед гибелью животных (Е. Н. Буркацкая, 1959). Можно сделать вывод, что угнетение иммуногенеза при действии перечисленных профессиональных ядов, так же как и в случае отравления свинцом, являлось отражением вторичных патологических процессов (видимо, угнетения синтеза всех белков). Первичные же процессы интоксикации на перестройку синтеза неспецифических белков (синтез антител) не влияли. Только при действии таких ядов, как бензол, четыреххлористый углерод, сернистый газ, гексаметилендиамин, нарушения имели место уже при первичном иммунологическом ответе на ранних стадиях отравления (П. А. Са медова, 1957 Г. А. Анненков, 1957 В. К- Навроцкий, 1960 Л. Эрбан и Я. Коржинек, 1960 А. Е. Кулаков, 1965). [c.284]

Биохимические исследования сосредоточены главным образом на идентификации местоположения индивидуальных рибосомных белков с помощью метода иммунной электронной микроскопии, на определении взаиморасположения соседствующих белков путем образования сшивок между ними и на анализе взаимодействий между определенными рибосомными белками и рРНК. [c.107]

Мы пришли к выводу, что для самых разнообразных иммунологических исследований необходимо получать максимально возможное количество нативного белка. Это легче всего достигается с помощью классических хроматографических методов, детально описанных в разд. 5.3.3.3, которые наиболее успешно работают при использовании экспрессирующих систем на основе плазмид pUR. Другие методы применяют, когда возникают сложности с выходом, растворимостью или стабильностью гибридного белка. Например, к выделению гибридных белков методом ДСН-электрофореза в ПААГ следует прибегать в последнюю очередь, а не использовать его сразу из-за его простоты, поскольку денатурированные ДСН белки меняют свои иммуно-генные свойства и с их помощью не всегда удается получить антисыворотку к нативному белку. Если антисыворотка в основном будет использоваться в вестерн-блот-анализе, то в этом случае денатурированные под действием ДСН иммуногены могут оказаться пригодными. Иммуноаффинные методы очистки можно эффективно использовать в ограниченном масштабе, поскольку, к сожалению, элюируемые белки, как правило, необратимо денатурированы реагентами, используемыми для разрушения комплексов антиген—антитело. С помощью хроматографии на АФТГ-агарозе можно получить чистый растворимый белок, но метод не очень эффективен и дает очень низкий выход белков, содержащихся в клетке в небольшом количестве или обладающих низкой стабильностью. Выбор того или иного метода поможет сделать анализ результатов прикидочного выделения и очистки. [c.155]

Выделение гибридных белков, содержащих -галактозида-зу, было детально описано в предыдущей главе. Для иммунизации мышей требуются относительно небольшие количества антигена, поэтому его можно наработать любым методом. Хотя белковый материал, полученный в результате препаративного ДСН-электрофореза в ПААГ, не всегда обладает такими имму-ногенными свойствами, которые присущи большинству нативных препаратов, он имеет то преимущество, что вызываемый им иммунный ответ обусловлен устойчивыми к денатурации эпитопами. Используемый нами метод выделения нерастворимых гибридных белков приведен в табл. 6.4. Моноклональные антитела к таким эпитопам часто удается с успехом использовать в последующем детальном иммунохимическом анализе белковых антигенов. Наличие абсолютно чистого иммуногена не требует- [c.180]

Предшествующая глава была посвящена рентгеноструктурным исследованиям белков, научная значимость и новизна которых обусловлены не столько методологическими и техническими достижениями кристаллографии, сколько важностью самих объектов анализа. В ней рассмотрены ставшие впервые известными лишь в 1990-е годы пространственные структуры молекул мембранных рецепторов, иммунных белков Т-лимфоцитов, гистонового октамерного кора нуклеосом, ДНК-топоизомеразы, аспартатных протеиназ ретровирусов и белков актомиозинового комплекса скелетных мышц. Рентгеноструктурный анализ получил широчайшее распространение и в течение более тридцати лет практически безраздельно определяет экстенсивное развитие морфологии биосистем атомно-молекулярного уровня. К настоящему времени с его помощью расшифрованы трехмерные структуры нескольких тысяч белков, полипептидных фрагментов и макромолекулярных комплексов. Вне сомнения, даже при сохранении сегодняшнего состояния рентгеноструктурного анализа изучение пространственного строения белков будет продолжаться в обозримом будущем с возрастающей интенсивностью как в отношении количества, так и сложности исследуемых объектов. Между тем, работы такого плана не дают полного представления о конформационных возможностях белковых молекул и не всегда приводят к объективным заключениям о [c.137]

В настоящее время 30% всех иммуноанализов в США включают применение изотопных меток. Остальные 70% выполняются в основном с помощью методов, в которых роль меток выполняют флуорофоры или ферменты. Применение нефелометрии ограничено анализом иммунных белков. Инфекционные заболевания в основном диагностируют с помощью гетерогенных методов с применением ферментных меток и бусин в качестве носителей, хотя 30% анализов выполняются с помощью более дешевых методик типа РИА. Контроль лекарственных препаратов осуществляют с помощью гомогенных методик, включающих применение ферментных меток или регистрацию поляризации флуоресценции. В случае анализа гормонов имеется большой выбор как гомогенных, так и гетерогенных методик с радиоактивными, ферментными и флуоресцентными метками. Доля неизотопных методов составляет 65% и имеет тенденцию к росту. Альтернативные методы йммуноана-лиза часто используются внутри определенной диагностической группы, например в анализах на тиреоидный статус. В США наиболее важным фактором является стоимость анализа, а различные технические аспекты обычно имеют второстепенное значение. В частности, 50% инструментального парка, используемого в иммуноанализе, работает с промышленно выпускаемыми реагентами. [c.19]

Закономерен вопрос, нельзя ли избежать отмеченных выше трудностей антигенного анализа, отказавшись от традиционной техники получения антител в результате иммунизации и оперируя вместо этого моноклональными антителами, полученными с помощью гибридомной техники (см. гл. 12). О чевидно, что для детального анализа антигенной структуры, например белков, необходимо использование большого числа индивидуальных клонов. Чтобы учесть генетические особенности иммунного ответа индивидуальных реципиентов, придется производить слияние с клетками плазмацитомы лимфоидных клеток от генетически неидентичных особей, отбор которых может быть ли,шь случайным. Тем самым степень неопределенности задачи не уменьшится. [c.30]

Чем же определяется генетический контроль иммунного ответа на уровне представляющих антиген макрофагов Как вытекает из данных генетического анализа, роль 1г-генов сводится к контролю синтеза 1а-белков (продукгов генов 1-района основного комплекса гистосовместимости), которые в мембране макрофага вступают в ассоциацию с фрагментами молекулы процессированного антигена. [c.215]

При изучении иммунных систем широко используется стандартный метод двойной иммунодиффузии, однако для получения тонких характеристик антител и антигенов может потребоваться анализ иммуноглобулинов в культуральных жидкостях или в сыворотках крови. В этих случаях сывороточные белки метят радиоактивным иодом, а иммуноглобулины, продуцируемые клетками в культуре, — биосинтетически или также иодом. [c.489]

Многие мембранные белки были охарактеризованы с помощью ДСН-ПАГЭ — метода, который широко применяется для нх анализа и идентификации (Ste k, Fox, 1973). К сожалению, ДСН препятствует образованию иммунных преципитатов, и многие белки оказываются необратимо денатурированными по- [c.64]

Белки играют центральную роль в процессах жизнедеятельности клеток (примером служат ферменты) и в формировании клеточных структур. Анализ содержания в крови определенных белков и ферментов широко используется в диагностических целях. В частности, при заболеваниях печени диагностическое обследование непременно включает электрофоретическое определение относительного содержания альбуминов и глобулинов в плазме крови. Арализ содержания в плазме липопротеинов и иммуноглобулинов с помощью электрофореза и других методов обычно используется при диагностике специфических типов гиперлипопротеинемии и иммунных нарушений. Моча человека в норме не содержит белков поэтому обнаружение в моче даже небольших количеств белка (протеинурия) с помощью соответствующих лабораторных анализов служит важным показателем заболевания почек, в частности различных форм нефритов. [c.42]

Иногда инактивированные вакцины вместо того чтобы предотвращать заболевание, усиливают его [50, 73]. Впервые это было отмечено для инактивированной формалином вакцины против вируса кори [50]. Первоначально эта вакцина предотвращала корь, но через несколько лет вакцинированные теряли устойчивость к этому заболеванию. При заражении вирусом кори у вакцинированных развивалась атипичная картина заболевания с выраженными системными симптомами и пневмонией [50, 125, 154]. Ретроспективный анализ показал, что формалин, использованный для инактивации, разрушал антигенные свойства коревого белка Р, но не изменял белка Н (гемагглютинирующий белок, обеспечивающий прикрепление к клеткам) [131, 132]. Таким образом, у вакцинированных возникала несбалансированная иммунная реакция, при которой развивался иммунный ответ на белок Н, но не на белок Р. Позднее было показано, что вакцинированные отвечали на парентеральное введение живого аттенуированного вакцинного вируса развитием в месте его введения реакции Артюса [17]. Это позволило предположить, что у вакцинированных в ответ на заражение диким типом вируса кори развивался ускоренный иммунный ответ на белок Н, что создавало условия для реакции Н-антиген — антитело с присущими ей иммунопатологическими последствиями. Формалин по-разному действовал также на поверхностные гликопротеины вирусов паротита и парагриппа антиген Р разрушался, в то время как антигенные свойства гемагглютинина — нейраминидазы (НЫ) сохранялись [133, 140]. [c.158]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология