Диализ белковых растворов

Одним из распространенных способов разделения белков на фракции является высаливание (стр. 14). Для этого применяют большей частью сернокислый аммоний в различных концентрациях. После прибавления к раствору белка (например, сыворотки крови) сернокислого аммония до полунасыщения вьшадает фракция белков, которая носит название глобулинов. Если отфильтровать глобулины и к фильтрату продолжать прибавлять сернокислый аммоний до полного насыщения, вьшадает осадок, получивший название фракции альбуминов. Изучение альбуминов и глобулинов обнаружило разницу в их физико-химических свойствах. Оказалось, что их растворимость в воде, также как в растворах солей неодинакова альбумины растворяются в дистиллированной воде, тогда как глобулины обычно растворяются в воде только в присутствии небольшого количества солей. На основании этого отделение глобулинов от альбуминов может быть произведено и путем диализа белкового раствора. В этом случае электролиты, удерживающие глобулины в растворе, проходят через полупроницаемую мембрану. По мере обеднения раствора солями глобулины выпадают в осадок, а альбумины остаются в растворе. Точно так же при большом разбавлении растворов белка (например, сыворотки крови) дистиллированной водой сыворотка мутнеет и в осадок выпадают глобулины вследствие понижения концентрации электролитов ниже той границы, при которой глобулины могут оставаться в растворенном состоянии. В табл. 5 приведены данные о растворимости альбуминов и глобулинов. [c.50]

В то время как одни белки выпадают из растворов при диализе, другие осаждаются при добавлении нейтральных солей (метод высаливания). Обычная процедура высаливания состоит в предварительном доведении pH раствора до изоэлектрической точки осаждаемого белка, ибо в изоэлектрическом состоянии растворимость белков минимальна. Затем к перемешиваемому белковому раствору добавляют насыщенный раствор соли (или твердую соль) до тех пор, пока не появится легкая опалесценция. После этого раствор оставляют при комнатной температуре или в рефрижераторе. Если концентрация солей очень высока, часто можно работать при комнатной температуре, так как в этих условиях размножение бактерий резко заторможено. Для осаждения белков чаще всего употребляют сернокислый натрий или сернокислый аммоний. Так, например, если доведенные до изоэлектрической точки растворы сывороточного или яичного альбумина обработать сульфатом аммония [9] или сульфатом натрия [10], то происходит медленное образование кристаллов альбумина, которые оседают на дно сосуда. Образование кристаллов обусловлено медленным испарением раствора. При избытке соли образуется аморфный осадок белка. В таких случаях кристаллы белка можно получить путем диализа белкового раствора против насыщенного раствора сернокислого аммония. [c.12]

Диализ является удобным методом очистки коллоидных растворов от низкомолекулярных веществ. При диализе коллоидный раствор помещают в коллодиевый или целлофановый мешочек и погружают в дистиллированную или водопроводную воду. Молекулы солей, сахара и других низкомолекулярных веществ легко диффундируют через мембраны, а вещества коллоидной природы остаются в мешочке. Метод диализа с успехом также используют для разделения глобу-линовой и альбуминовой фракций белка. По мере уменьшения концентрации соли в процессе диализа глобулины выпадают из раствора в осадок, а альбумины остаются в растворе. [c.28]

При экстракции белков из муки, полученной из семян рапса, альбумины имеют тенденцию во время диализа осаждаться вместе с глобулинами [103]. Что касается подсолнечника, то избирательного осаждения глобулиновой фракции белков, растворимых в солевом растворе, достигают подкислением среды до pH 4,6 и диализом против раствора 20 мМ уксуснокислого натрия при pH 4,6. Глобулиновую фракцию, отделенную центрифугированием, затем суспендируют в воде и вновь растворяют, доводя pH до 7,5 добавлением 0,05 н. раствора едкого натра. [c.153]

Известно, что все ферменты являются веществами белковой природы. Молекулы многих из них — это обычные, характерные молекулы белков, не содержащие иных дополнительных компонентов иными словами, это — простые белки. Однако уже давно доказано, что многие ферменты обладают каталитически активными простетическими группами небелковой природы, т. е. представляют собой сложные белки. Простетические группы обычно можно отделить от белковой части различными способами диализом, пропусканием раствора через сефадекс, и др. Для таких сложных ферментов обычно принимают следующие термины если диализируемая часть представляет собой органическую молекулу, ее называют коферментом белковую часть называют апоферментом, а их соединение определяют как голофермент. Коферментами часто являются молекулы витаминов. Большая часть окислительно-восстановительных ферментов имеет кофер-ментные группы. Интересно, что этот термин редко применяют к ионам металлов, хотя они часто выполняют ту же характерную функцию. [c.39]

Растворы белков имеют коллоидный характер и могут быть очищены диализом. Из растворов белки легко осаждаются органически- [c.295]

С помощью различных технических приемов можно сделать белки нерастворимыми. Некоторые из этих способов, как, например, термическая коагуляция, вызывают необратимые изменения белков. Предпочтение в первую очередь отдается тем технологиям, которые сохраняют у белков способность вновь переходить в растворимое состояние (функциональные свойства) в условиях, приближенных к нативным. Сюда относится случай осаждения белков при изоэлектрической точке или диализом солевых растворов белков. Однако степень осаждения может быть ниже степени коагуляции по разным причинам [c.424]

Растворы белков имеют коллоидный характер и могут быть очищены диализом. Из растворов белки легко осаждаются органическими водорастворимыми растворителями (спиртом, ацетоном), растворами солей, особенно солей тяжелых металлов (Си, РЬ, Hg, Ре и др.), кислотами и т. д. Осаждением растворами солей различной концентрации белки могут быть очищены и разделены. При осаждении некоторые белки меняют структуру и переходят в нерастворимое состояние. Этот процесс называется денатурацией. Денатурация наступает для многих белков и при нагревании. [c.334]

Многие белки растворимы в воде, в разбавленных растворах солей, в кислотах. Почти все белки растворяются в ш,елочах, и все они нерастворимы в органических растворителях. Растворы белков имеют коллоидный характер и могут быть очищены диализом. Из растворов белки легко осаждаются органическими водорастворимыми растворителями (спиртом, ацетоном), растворами солей, особенно солей тяжелых металлов (Си, РЬ, Hg, Ре и др.), кислотами и т. д. Осаждением растворами солей различной концентрации белки могут быть очищены и разделены. При осаждении некоторые белки меняют конформацию цепей и переходят в нерастворимое состояние. Этот процесс называется денатурацией. Денатурация многих белков может быть вызвана и нагреванием. [c.506]

Если же высаливание проводилось, то можно сразу получить высокоактивный препарат (1 10 000). В этом случае возможно избегнуть таких денатурирующих и неудобных операций, как диализ, подщелачивание растворов, вакуум-выпаривание, которые проводились обычно, а также загрязнения большими количествами денатурированных тканевых белков. [c.206]

Третья глава посвящена физико-химии очистки и фракционирования ферментов. Вначале даются общие приемы фракционирования белков и излагается теория процесса диализа белковых растворов. Обращается внимание на влияние распределения электролитов при диализе, а также на освобождение от балластных веществ путем изменения pH вытяжек (экстракт культур плесневых грибов), и обесцвечивание ферментных растворов некоторыми ионитами. Здесь же приведены принципиальные схемы получения высокоочищенных ферментных препаратов. [c.3]

В процессе диализа белки делятся на фракции, причем альбумины переходят в раствор, а глобулины остаются в осадке. [c.246]

Степень связывания ионов белками можно определять различными методами из них наиболее широко распрострапен метод равновесного диализа. При диализе (так же как и при осмометрии) используют мешочек, стенки которого непроницаемы для молекул белка, но проницаемы для небольших ионов. Диализный мешочек с раствором белка помещают в раствор, содержащий необходимый ион. После установления равновесной концентрации диффундирующего иона по обе стороны мембраны измеряют концентрацию иона в растворе, не содержащем белка разность начальной и конечной концентраций иона в не содержащем белка растворе позволяет определить концентрацию иона в растворе белка. Если концентрации иона по обе стороны мембраны равны друг другу, то это означает, что связывания не произошло. Если связывание имело место, то концентрация иона в белковом растворе должна быть выше, чем в растворе, не содержащем белка разность концентраций может служить мерой числа ионов, связанных с одной молекулой белка. Для того чтобы исключить влияние эффекта Гиббса — Доннана, равновесный диализ проводят обычно либо в изоэлектрической точке белка, либо при высокой ионной силе. Такие методы, как ультрафильтрация, распределительный анализ, а в некоторых случаях и адсорбционная спектрофотометрия, также могут служить для определения степени связывания ионов с белками. [c.73]

Искусственные мембраны имеют преимущество по сравнению с естественными, так как их можно готовить с различной и хорошо воспроизводимой проницаемостью. При выборе материала для мембраны часто необходимо принимать во внимание заряд мембраны в том или ином растворителе, который возникает в результате или диссоциации самого вещества мембраны (см. раздел 11.3), или избирательной адсорбции на ней ионов (см. раздел 10.3), илн неравномерного распределения ионов по обе стороны мембраны. Наличие заряда у мембраны иногда может быть причиной коагуляции (см. раздел 9.5) при диализе коллоидных растворов, частицы которых несут заряд, противоположный по знаку заряду мембраны. Поверхность целлофановых и коллодиевых мембран в воде и водных растворах обычно заряжена отрицательно. Белковые мембраны в среде с pH,меньшим изоэлектрической точки белка, заряжены положительно, а в среде с большим pH — отрицательно. [c.497]

Перед электрофорезом белки, экстрагированные одним из указанных способов, необходимо подвергнуть диализу против раствора, содержащего мочевину и буфер концентрирующего геля или какой-либо сходный с ним буфер. В случае разрушения рибосом рибонуклеазами А или Тг [1299] этот этап можно исключить. [c.311]

Диализ разведение раствора белков до 57о pH 6,5, осаждение белков при концентрации сульфата аммония 1,5 М [c.155]

В процессе выделения фермента из дрожжей происходит частичное отщепление от него тиаминпирофосфата. Полное отделение можно получить, выдерживая фермент в щелочной среде (pH 8,0) или путем диализа против раствора ЭДТА. Взаимодействие кофермента с апо-ферментом осуществляется при участии ионов двухвалентных металлов, таких как Mg +, ea +, Мп2+ и др. В нативной холотранскетолазе обнаружен только кальций в количестве 2 г-атом на моль белка. [c.279]

Раствор яичного белка для реакций высаливания и диализа, Белки трех куриггг, х яиц отделяют от желтков и растворяют в 700 мл дистиллированной воды, к которой прибавляют 300 мл пасытенного раствора хлористого натрия. Раствор фильтруют через марлю, сложенную в [c.6]

Т. Лорент развил иную трактовку механизма эксклюзии, которая в большей степени соответствует реальной структуре геля. Он считал, что набухший гель можно уподобить раствору полимера. Влияние, которое кислый полисахарид (гиалуроновая кислота) оказывает на седиментацию макромолекул, можно объяснить лишь образованием из полимерных цепей трехмерной сетки, которая действует в отношении макромолекул как молекулярное сито [23]. Если к раствору белка прибавлять высокомолекулярный декстран, то по мере увеличения концентрации полисахарида белок осаждается [24, 25]. Можно представить, что при растворении декстран связывает часть воды за счет гидратации, что приводит к осаждению белка. Фактически в этом случае высокомолекулярный белок осаждается в большей степени, чем низкомолекулярный [24]. В другой серии опытов Лорент [26] сравнивал эксклюзию белков (при равновесном диализе против раствора гиалуроновой кислоты) с их поведением при хроматографировании на геле гиалуроновой кислоты равной концентрации [27]. Расчеты подтвердили предположение, что гиалуроновая кислота (независимо от присутствия поперечных мостиков) образует в водном растворе непрерывную сеть, состоящую из длинных линейных цепей. [c.118]

Раствор белка, содержащий хлористый натрий, для высаливания и диализа. Белки трех куриных яиц отделяют от желтков, смешивают с 700 мл дестиллированной воды и с 300 мл насыщенного раствора хлористого натрия и фильтруют через несколько слоев марли. [c.329]

Приготовление растворов белка. Белки инкубируют при 37 °С в течение двух часов в 0,01 М фосфатном буфере, pH 7 с 1%-ным натрийдодецилсульфатом и с 1%-ным р-меркаптоэтанолом. В случае тропомиозина, парамиозина и миозина белки растворяли в этом буфере в присутствии 8 М мочевины. Концентрация белка выбирается между 0,2 и 0,6 мг/мл. После инкубации растворы белка диализуют несколько часов при комнатной температуре против 500 мл 0,01 М фосфатного буфера pH 7, содержащего 0,1%-ный натрийдодецилсульфат и О, %-ный р-меркапто-этанол. В большинстве случаев этап диализа опускается и белок непосредственно растворяют в диализном буфере. [c.422]

В настоящее время диализ используют главным образом для удаления веществ, имеющих небольшой размер молекул, из водных растворов белков и других высокомолекулярных растворенных веществ, а также для сгущения белковых растворов. При диализе концентрированных растворов часто диализациониый мешок завязывают с обоих концов, однако в результате этого, как будет показано ниже, развивается высокое осмотическое давление, которое может привести к нежелательным результатам. Кроме того, не рекомендуется проверять диализационную трубку под давлением на отсутствие точечных проколов. [c.213]

Авторы работы [426] удаляли амфолин двумя различными методами. По одной из методик фракции подвергали диализу в подходящем буферном растворе. После этого проводили обращенный диализ в растворе сульфата аммония для осаждения белка, который затем удаляли центрифугированием. В соответствии с другой методикой объем фракции вначале уменьшали с 3 до 2 мл ультрафильтрацией и после этого проводили диализ in situ в буферном растворе до тех пор, пока объем фракции не увеличивался в 2—3 раза. После этого объем снова уменьшали отгонкой при уменьшенном давлении до окончательного требуемого объема, величина которого зависела от концентрации белка. [c.178]

В заключение необходимо подчеркнуть, что нами были рассмотрены методы изучения конформации РНК in vitro, и распространять результаты, полученные этими методами, на описание конформации РНК in vivo можно только в плане предположения. Стараясь получить особо чистые препараты РНК, мы, по крайней мере в некоторых случаях, теряем их нативную структуру. Так, многократная фенольная экстракция для отделения последних следовых количеств белка, длительный диализ против растворов комплексообразующих агентов для удаления ионов металлов и кратковременное прогревание с целью разрушения агрегатов, несомненно, могут приводить к денатурации исходной структуры РНК. Правда, в случае РНК ВТМ было показано, что все перечисленные воздействия не влияют па ее ипфекционность [59]. Необходимо провести аналогичные эксперименты и для других видов РНК, чтобы доказать, что все нарушения в их структуре в процессе выделения имеют обратимый характер. [c.271]

Коферменты. Уже в ранних работах с ферментами дрожжей было замечено, что при диализе ферментных растворов происходит их инактивация. Однако при добавлении отдиализованного материала к ферменту он снова становился активным. Кофактор в диализате называется коферментом. С тех нор были открыты многие коферменты было также обнаружено, что они представляют собой малые органические молекулы и идентичны нростетиче-ским группам фермента. На этом основании многие ферменты относят к сложным белкам, состоящим из неактивной белковой молекулы, которую называют апоферментом, и про-стетической группы, или кофермента. [c.334]

Приготовление полимеров белков по методу Вольфа и др. [М40]. 2 мг белка растворяют в 1 мл воды, добавляют 20 мкл диэтилпирокарбоната и перемешивают с максимальной скоростью на вихревом смесителе (Vortex) в течение 2—3 мин при комнатной температуре. Избыток диэтилпирокарбоната удаляют лиофилизацией или диализом против буфера, содержащего 0,01 М фосфат (pH 7,8), 1% ДСН и 1% 2-меркаптоэтанола. [c.226]

Некоторые мембранные белки растворяются в дистиллированной воде [192, 844] или забуференных растворах [812, 814, 889]. Для частичной солюбилизации мембранных белков была использована их обработка 33%-ным раствором пиридина с последующим диализом против дистиллированной воды [137]. Белковые компоненты базальной мембраны почечных клубочков человека можно избирательно солюбилизировать с помощью хаотропных агентов [825]. Почти все мембранные белки переходят в растворимое состояние в этаноле, содержащем 1% уксусной кислоты [849]. [c.315]

Окисление надмуравьиной кислотой. Для получения надмуравьиной кислоты смешивают 99%-пую муравьиную кислоту и 30%-ный пероксид водорода в соотношении 95 5 и оставляют стоять в закрытом сосуде при комнатной температуре в течение 2 ч. К этому времени содержание надмуравьино кислоты в реакционной смеси достигает максимального, а затем постепенно снижается. Навеску белка растворяют в 99%-пой муравьиной кислоте, добавляют метанол (до 20%-ной концентрации), охлаждают до —5 С и добавляют надмуравьи-ную кислоту (1 мл на 5 мг белка) в соотношении 2 1, Окончательная концентрация белка в реакционной смеси составляет --0,5%. Инкубируют при —5 --10Х в течение 2—3 ч, разбавляют водой и высушивают лиофильно. Белок можно выделить из раствора осаждением трихлороуксусной кислотой или оога ническим растворителем. Реакционную смесь можно разбавить вдвое охлажденной водой и диализовать на холоду против воды (дважды) и 1 мМ 2-меркаптоэтанола, а затем высушить лиофильно. См. также разд, 1.5.1.1. [c.91]

Полученный раствор ферментного препарата прогревают на водяной бане при 58 С в течение 10 мин при no TOHrfHOM перемешивании. Затем для удаления денатурированных балластных белков раствор препарата центрифугируют при 40 00 g в течение 15 мин. Надосадоч-ную фракцию диализуют против 10 мМ фосфатного буфера (pH 7,0) до полного освобождения от ионов аммония. [c.11]

Выпавший после диализа осадок белка удаляют центрифугированием на ЦВР в течение 60 мин при 2800р g, а надосадочную жидкость сгущают в роторном испарителе при 20—22°С. Сгущенный раствор фермента вновь диализуют против раствора А и отделяют от образовавшегося осадка центрифугированием. Объем сгущенного раствора фермента не должен превышать 5—6% от общего объема геля сефадекса в колонке. [c.107]

Исходный белковый препарат растворяют в том же рабочем буфере, но меньшей концентрации (в 5—10 раз). По рассмотренным выше причинам это приводит к значительному сужению исходной зоны белков при ее вступлении в гель. Если электрофорез идет в присутствии мочевины, то ее концентрация в разбавленном буфере должна быть такой же, как в рабочем буфере геля. Еще раз подчеркнем необходимость удаления солей из препарата в противном случае эффект концентрирования белка при вступлении в гель будет смазан. Недавно был предложен простой и остроумный способ диализа белкового раствора в капле на плавающем мембранном фильтре [Marusyk, Sergeant, 1980]. [c.52]

Процесс, аналогичный описанной выше самосборке мембран, используют для создания искусственных мембранных пузырьков — протеолипосом — с заданным составом. Для этого выбранные липиды и белки растворяют в растворе детергента, а затем детергент удаляют диализом. При этом можно получить и асимметричные мембраны если белок, имеющий гидрофильную и гидрофобную части, добавить к суспензии уже готовых липосом, то он будет включаться только в наружную поверхность липосомы. Липосомы широко используют для моделирования и изучения свойств мембран. Изучается возможность применения липосом в качестве капсул для введения в организм лекарств. Липосомы, введенные через желу-дочно-кишечный тракт, попадают в кровь, а затем улавливаются органами (главным образом печенью и селезенкой) и разрушаются в их клетках. Путем подбора мембранных компонентов можно получить липосомы, избирательно задерживающиеся в том или ином органе с помощью таких липосом можно направить лекарство точно по адресу — в пораженный орган. [c.206]