Ферментативная активность измерение

Рис. 9-7. Количественное определение ферментативной активности. Эта процедура проводится в три этапа 1) определение /С (рис. 9-4 и дополнение 9-2), 2) измерение начальных скоростей (А) при различных концентрациях фермента и при концентрации субстрата, близкой к насыщающей, например при концентрации, равной 10 Км.

Кинетические параметры (измеренные по ферментативной активности) при варьировании концентрации глюкозо-1,6-дифосфата и глю-козо-1-фосфата зависят от соотношения концентраций этих компонентов. Величина Кт для глюкозо-1-фосфата изменяется от 2,4-10 М до 4,8-10 М. для глюкозо-1,6-дифосфата — от 8,3-10 М. до 7,6-10 М. Кинетические параметры зависят также от того, находится ли фермент в активированном или неактивированном состоянии. Активацию фосфоглюкомутазы проводят путем предварительной инкубации в среде, содержащей ионы Mg + и имидазол (или гистидин). [c.227]

Проведя на колонке с гелем измерение Fe для нескольких белков с известной молекулярной массой, т.е. фактически осуществив градуировку колонки, можно определить Vg для исследуемого биополимера и путем интерполяции с помощью соотношения (7.6) найти его молекулярную массу. Существенно, что гель-хрома-тографию можно проводить в мягких условиях, сохраняя белок в нативном, функционально активном состоянии. Если в распоряжении экспериментатора имеется специфический тест на этот белок, пригодный для его выявления в смеси с другими белками, например определенная ферментативная активность, то определить молекулярную массу можно даже в неочищенном препарате белка т.е. уже на промежуточных стадиях его очистки. Если полимер имеет четвертичную структуру, то, как правило, она сохраняется в условиях разделения и молекулярная масса представляет собой сумму масс составляющих белок субъединиц. [c.268]

Глутаматдегидрогеназа находится в состоянии равновесия ассоциации — диссоциации с субъединицами, обладающими ферментативной активностью молекулярный вес минимальной по массе ферментативно активной субъединицы равен 310 000 [9, 10]. Из результатов измерения вязкости и рассеяния рентгеновских лучей под малыми углами следовало, что молекула этого фермента имеет удлиненную форму в ассоциированном состоянии, а при диссоциации происходит ее поперечное расщепление [8]. Данные электронной микроскопии (рис. 5) подтвердили это заключение. Субъединицы с М 310 ООО состоят из полипептидных цепей (М 50 ООО—60 000), обнаруживаемых в условиях денатурации. [c.401]

ЧТО эквивалентно степени гидратации 0,22, соответствует последней стадии процесса гидратации согласно данным по измерению теплоемкости, т. е. завершению формирования монослоя в результате конденсации воды над наиболее слабо взаимодействующими участками поверхности. Ферментативная активность в конце первой стадии составляет 10% значения для разбавленного раствора. Увеличение активности в ходе первой стадии обнаруживает зависимость от активности воды в степени 1,5. Следовательно, скорость реакции не лимитируется водой, которая является реагентом в гидролитических процессах, когда кинетический порядок реакции по воде равен единице. Активность увеличивается до значения, характерного для разбавленного раствора, с увеличением степени гидратации выше 0,5 г воды/г белка. [c.130]

Пояснения. Динамические свойства обнаруживают изменения при уровнях гидратации выше 0,4 г воды/г белка, что соответствует моменту завершения изменений статических свойств. Вследствие того что последние отражают формирование монослоя воды вокруг молекулы белка, дополнительная вода, обнаруживаемая при измерении динамических свойств, представляет собой воду многослойного покрытия. Кроме того, гидратация в значительной степени влияет на некоторые кинетические свойства. Следует ожидать более сложной зависимости от степени гидратации для динамических свойств, чем для статических. Все статические свойства (по крайней мере термодинамические) имеют простую молекулярную основу. Разнообразные переходные состояния, управляющие кинетикой, напротив, должны непременно отличаться друг от друга. В самом деле, замечательно, что согласие между данными динамических и статических измерений оказывается таким хорошим при определении последовательности стадий во время протекания процесса гидратации. Как отмечено выше, каждый из методов— ЯМР-спектроскопия, измерения диэлектрической релаксации, ЭПР-спектроскония и измерения ферментативной активности — определяет одну или более стадий процесса гидратации, что проявляется при измерении статических свойств. [c.130]

Д. Конденсация воды над наиболее слабо взаимодействующими участками поверхности (неполярными областями) приводит к образованию многослойного покрытия при степени гидратации 0,4 г воды/г белка. На поверхности белка вода должна располагаться особым локальным образом для достижения высокого значения степени покрытия в расчете на одну молекулу адсорбированной воды. Конденсация является главным этапом процесса гидратации. Это видно из результатов измерения теплоемкости, т. е. статических измерений, и является тем пунктом, с которого начинается изменение динамических свойств (диэлектрической релаксации, времени корреляции для спиновой метки, ферментативной активности). Подвижность системы белок — вода резко увеличивается после завершения формирования монослоя. [c.134]

Взаимодействие воды с белками можно эффективно изучать, используя твердые образцы, так как это позволяет контролировать активность воды. Для многих белков и молекул близкого строения были получены изотермы сорбции воды, что дает возможность определить изменение свободной энергии и энтальпии при различных уровнях гидратации. Измерения теплоемкости, выполненные во всем диапазоне составов системы, позволяют сопоставить результаты исследований, проведенных на частично гидратированных твердых образцах, с одной стороны, и в разбавленном растворе — с другой. Результаты измерений термодинамических свойств позволяют выделить отдельные стадии гидратации и нарисовать общую картину процесса. При построении такой картины использованы результаты других статических измерений, в частности данные ИК-спектроскопии, и результаты кинетических измерений, например данные по спектрам ЭПР и по ферментативной активности. Ферментативная активность проявляется еще до окончания формирования многослойного покрытия, и ее увеличение связано, по-видимому, с конденсацией. Кинетические свойства твердого белка продолжают изменяться выше уровня гидратации (около 0,4 г во-да/г белка), который достаточен для установления уровня термических свойств, характерного для разбавленного раствора. Обсуждена структура твердого белка в зависимости от уровня гидратации. [c.135]

Определению ферментативной активности могут мешать конкурентные побочные реакции. Концентрации субстратов или образующихся веществ могут настолько сильно меняться в результате таких конкурентных реакций, что точное измерение активности становится невозможным. [c.388]

Наиболее важные сведения о химической природе анионных центров могут быть получены путем измерения рК соответствующих групп. Однако в опытах, поставленных с этой целью, встретились большие осложнения. Из рис. 2 видно, что ферментативная активность может быть измерена только при pH выше 5. Поэтому анионный центр с р/( ниже 5 не должен претерпевать никаких структурных изменений в интервале pH, где [c.309]

Исследование зависимости скорости ферментативной реакции от таких условий, как концентрация субстрата, концентрация фермента, pH, температура, присутствие активаторов или ингибиторов может дать ценные сведения о строении и механизме действия ферментов. Измерение скоростей ферментативных реакций является также основой для определения и сравнения ферментативной активности разных препаратов и сравнения последней в условных единицах. [c.218]

Оптимальные параметры затирания определяют на основе лабораторных исследований, экспериментов по дистилляции или тех и других. Наиболее важными параметрами являются температура и значение pH. Степень измельчения солода проверяется методами ситового анализа. Ареометрические измерения плотности не могут полностью отразить ход затирания, в связи с чем измеряют другие показатели, в частности, содержание аминного азота, значение pH, вязкость сусла, состав сахаров и остаточного крахмала, а также ферментативную активность [32]. [c.325]

Поскольку ферментативная активность выражается в международных единицах (МЕ) и 1 МЕ равна такому количеству фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоля субстрата за 1 мин в стандартных условиях, скорость счета следует выражать в мкмоль/мин, используя удельную активность субстрата (который будет превращен в продукт предположительно с такой же удельной активностью). При определении удельной активности субстрата путем измерения радиоактивности и концентрации часто допускаются ошибки. Хотя удельная активность применяемого радиоизотопа обычно известна с точностью до 5%, этот препарат редко используется как таковой, чаще он разбавляется большими количествами нерадиоактивной формы, что приводит к соответствующим погрешностям в измерениях радиоактивности и в определении чистоты препарата. Поэтому рекомендуется точно определять удельную радиоактивность субстрата, используемого в экспериментах. Кроме того, может возникнуть необходимость проверки радиохимической чистоты субстрата или его предварительной очистки с целью удаления продуктов распада и других примесей. [c.245]

Денатурация белка в классическом смысле определялась как любая непротеолитическая модификация уникальной структуры нативного белка, приводящая к определенным изменениям химических, физических и биологических свойств [388]. Из этого определения исключаются изменения состояния ионизации, если только они не сопровождаются конформационными переходами. Денатурация может происходить в результате нагревания, изменения pH и добавления неполярных растворителей или некоторых специфических денатурирующих реагентов, например мочевины или солей гуанидина. Она также может быть вызвана восстановительным или окислительным разрывом дисульфидных связей, которые стабилизуют нативные конформации некоторых белков. Денатурация, как правило, сопровождается уменьшением растворимости белка. Это можно легко понять, так как гидрофобное взаимодействие, стабилизующее нативную конформацию, приводит к межмолекулярной агрегации, если полипептидные цепи принимают вытянутые конформации. Другим характерным последствием денатурации является раскрытие реакционноспособных групп, которые расположены внутри третичной структуры и становятся доступны воздействию реагентов при разрушении этой структуры. К числу наиболее пригодных методов наблюдения за процессами денатурации принадлежат спектроскопические измерения, измерения оптической активности и определение каталитической активности ферментов или биологической активности гормонов. Конформационные переходы при денатурации включают ряд процессов, которые в различной степени могут сказываться на каждом из наблюдаемых изменений, и поэтому понятие степени денатурации бессмысленно, если не будет установлен критерий, с помощью которого денатурация измеряется. Эта точка зрения иллюстрируется рис. 44, на котором изображено изменение оптической активности, поглощения света и ферментативной активности рибонуклеазы [389]. [c.136]

Молекула киназы фосфорилазы состоит из субъединиц четырех типов ар б. Молекулярная масса фермента — 1,3-10 Да — отвечает формуле (аРуб)4- Киназа фосфорилазы играет, как показано, ключевую роль в регуляции обмена гликогена и в сопряжении гликогенолиза и мышечного сокращения. В скелетной мускулатуре она существует в двух молекулярных формах нефосфорилированной ( неактивированная ) и фосфорилированной ( активированная ). Первая активна лищь при pH 8,2, вторая — при pH 6,8 и 8,2. При активации фермента отнощение активностей, измеренных при pH 6,8/8,2, возрастает от 0,05 до 0,9—1,0. Активация киназы достигается фосфорилированием а- и р-субъединиц, которое катализирует цАМФ-зависимая протеинкиназа. Каталитическую роль выполняет -субъединица б-субъединица идентична a +- вязывaющeмy белку — кальмодулину. Ферментативная активность киназы фосфорилазы полностью зависит от ионов На р-субъединице фермента имеется регуляторный центр, обладающий высоким сродством к АДФ. Константа Михаэлиса для АТФ равна [c.223]

Определение константы скорости инактивации фермента ротено-ном. Выделяют препарат Кейлина—Хартри, Кювету рН-метра (объ-<емом 4,5 мл) заполняют средой измерения активности (п. 2) и добавляют НАДН до конечной концентрации в кювете, равной 1 мМ. В кювету погружают отмытый рН-электрод, через 2—3 мин вносят 50 мкл суспензии Кейлина—Хартри ( — 25 мг/мл) и регистрируют изменение pH в ходе НАДН-оксидазной реакции. По ходу реакции в кювету вносят ротенон (0,1 мкМ) и наблюдают ингибирование ферментативной активности, связанное с образованием каталитически неактивного комплекса фермент-ротенон. Внося ингибитор в различных концентрациях (0,025 0,05 0,075 0,1 0, 5 мкМ), определяют зависимость скорости инактивации от концентрации ротенона и рассчитывают величину константы второго порядка скорости инактивации фермента ингибитором. [c.441]

При измерении активности на рН-метре необходимо после завершения каждого измерения определять цену деления шкалы на самописце. Для этого в кювету вносят небольшой объем (0,02—0,05 мл) титрованной НС1 (50 мМ) и фиксируют величину отскока пера самописца. 3. Ферментативную активность выражают в мкмолях окисленного НАДН за 1 мин в расчете на 1 мг белка препарата Кейлина — Хартри. [c.442]

Выделяют митохондрии из печени крысы. В кювету рН-метра наливают 4,5 мл среды измерения активности (п. 2) и погружают отмытый рН-электрод. Через 2—3 мин в кювету вносят 20—50 мкл суспензии митохондрий (2—4 мг) белка. Убеждаются в том, что нативные митохондрии не катализируют реакцию гидролиза АТФ в отсутствие разобщителя. Через 1 мин после внесения митохондрий в кювету добавляют динитрофенол до конечной концентрации, равной 0,1 мМ. Внесение разобщителя приводит к снятию трансмембранного электрохимического потенциала ионов водорода и активации реакции гидролиза АТФ. Измерение повторяют, в кювету после добавления митохондрий вместо динитрофенола вносят детергент тритон Х-100 до конечной концентрации 0,1%- Наблюдают, как и в случае динитрофенола, стимуляцию реакции. Выбирают концентрацию тритона (в интервале от 0,02 до 2%) дегя проявления максимальной ферментативной активности. [c.460]

К 200 мкл густой суспензии митохондрий ( 50 мг/мл), стоящей на льду, добавляют N-этилмалеимид до конечной концентрации 0,5 мМ и инкубируют 30 мин. Измеряют АТФазную активность в суспензии, как описано выще. Наблюдают инактивацию ферментативной реакции, измеренной в присутствии динитрофенола, вызванную модификацией фосфатного переносчика. Добавление по ходу реакции тритона Х-100 в оптимальной концентрации, определенной ранее, приводит к снятию барьера проницаемости для фосфата и восстановлению активности. [c.460]

Сравнение данных по измерению удельного оптического вращения и дисперсии оптического вращения глобулярных белков в водных растворах и растворах, насыщенных углеводородом, позволило сделать вывод, что солюбилизированный углеводород практически не изменяет содержания спиральных структур в глобулах белков. Влияние солюбилизации углеводорода на устойчивость глобулярных белков к тепловой денатурации изучалось на примере яичного альбумина при pH 7,2, химотрипсина при pH 4,25 и 7-глобулина при pH 9,2 — по изменению удельного оптического вращения. Тепловая денатурация у-глобулина при pH 9,2 оценивалась также спектрофотометрически, а тепловая денатурация трипсина при pH 3,75 — по снижению ферментативной активности. [c.30]

Кинетические методы предусматривают инициирование химической реакции и последуюш,ее наблюдение за ее развитием во времени. Метод часто используется при определении дегидрогеназ человека [12]. Одним из наиболее важных соединений этого класса является а-гидроксибутиратдегидрогеназа (GBD), измерение концентрации которой в сыворотке крови проводится при диагностике инфаркта миокарда. Авторами работ [13, 14] предложен метод определения концентрации GBD при по.мощп специального спектрофотометра, называемого анализатором скорости реакции. Принцип метода заключается в следующем GBD катализирует реакцию (субстрат +МАО продукт + -fNADH-f-H+ (где NAD — р-никотинамидадениндинуклеотид) следовательно, скорость этой реакции, которая может контролироваться по интенсивности поглощения при 340 нм, является мерой ферментативной активности и соответственно концентрации. В прибор помещают одиовремепио до 16 образцов, где они последовательно автоматически анализируются. Результаты могут быть либо представлены в виде графика (и тогда их обработку проводит сам экспериментатор), либо переданы в компьютер (через соответствующий электрический интерфейс) для автоматической обработки. [c.28]

Диксон и Нейрат [152] попытались непосредственно наблюдать образование N-ацилимидазольных производных при ацилировании химотрнпсина -нитрофенилацетатом. В отличие от первоначальных результатов [138] эти исследователи показали, что на стадии ацилирования можно наблюдать быстрое увеличение поглощения при 245 ммк, которое затем медленно убывает со временем. Зная, что N-ацетилимидазол имеет .ма. с при 245 ммк и е 3-10 , можно рассчитать, что увеличение поглощен11я обусловлено ацилированием примерно 0,4 моля имидазольных групп в 1 моле химотрипсина. Кроме того, найдено, что константа скорости первого порядка, вычисленная по убыванию поглощения при 245 ммк, близка к константе скорости деацилирования 6-хи-мотрипсина, измеренной по появлению ферментативной активности. Показано, что скорость восстановления ферментативной активности, в свою очередь, соответствует скорости деацилирования N-ацетилимидазола. Однако в настоящее время считают, что поглощение при 245 ммк не связано со стадией ацилирования, а характеризует физическое состояние белка [15, 161]. [c.281]

Как видно из фиг. 122, молекула пепсина состоит из одной полипептидной цепи с N-концевым изолейцином и С-концевым аланином. В молекуле имеются три дисульфидных мостика (образованных за счет всех наличных остатков цистеина). Два из них необходимы для ферментативной активности. Гидродинамические измерения показывают, что молекула пепсина обладает весьма компактной структурой, хотя в ней, по-видимому, илюется лишь небольшое число а-спиральных участков. [c.424]

Авторы благодарят Патрицию Адамс за измерения ферментативной активности образцов лизоцима и профессора Уолтера Каузмана за содействие и критическое обсуждение. Настоящая работа субсидировалась Институтом военно-морских исследований (фонд ОМ-24760). [c.135]

Шилдкнехт и Маннель (1957), работая с Лейшне-ром, изучили поведение двух ферментов — каталазы и ариламинацетилазы. Было найдено, что оба фермента концентрируются в конце жидкого образца, подвергнутого зонной плавке. Раствор каталазы, содержащий в 1 мл 10 мг белкового фермента, был разбавлен и использован в концентрации 0,2 мг/мл. Фракции образца после зонной обработки были проанализированы путем измерения количества разложившейся перекиси водорода за определенное время. Общая потеря активности после 21-го зонного прохода составляла 15%. Образец был разделен на четыре равные фракции и было найдено, что ферментативная активность в последней части была в 8 раз больше, чем в первой. [c.105]

Явление расплющивания белков на других межфазных поверхностях вода/воздух, вода/масло и т. п. давно известно. Для изучения состояния пленки обычно используется метод измерения поверхностного давления. В работах [ 10—12] и многих других более ранних таким методом было найдено,, что при низких поверхностных давлениях, когда белка меньше 0,07мкг1см , независимо от структуры и молекулярного веса происходит полное расплющивание и развертывание глобулярного белка до толщины одной полипептидной цепи, т. е. около 7—10 A. Такая пленка обладает особыми свойствами, и, в частности, белки в ней необратимо денатурированы и обладают значительно пониженной растворимостью. При больших поверхностных давлениях в адсорбционном слое преобладают глобулярные молекулы, сохраняющие нативную структуру и ферментативную активность. Толщина такой пленки сравнима с линейными размерами молекулы. В области промежуточных давлений пленки состоят из смеси глобулярных и развернутых молекул. [c.232]

Хенкенс и Стюртевант [87] детально изучили кинетику взаимодействия цинка с апоферментом. Реактивация белка цинком сопровождается небольшими изменениями ультрафиолетовых спектров [87]. Измерения скорости комплексообразования проводились методом остановленной струи. Степень взаимодействия определя.лась по изменению оптической плотности и по увеличению ферментативной активности. Реакция имеет первый порядок как по апоферменту, так и по цинку. Значение константы скорости — около 10 л- моль -с . Эта величина примерно на два порядка меньше, чем при взаимодействии цинка с небольшими хелатирующими агентами, для которых получены значения 10 —10 л-моль -с [87 — 89]. В последнем случае считают, что скорость процесса лимитируется вытеснением воды из координационной сферы [87]. Скорость [c.579]

Ферментативный катализ альдольной конденсации также можно условно разделить на составляющие стадии. Нативная альдолаза катализирует стереоспецифическое отщепление протона от фосфата диоксиацето-на, причем было найдено, что скорость этой реакции, измеренная по обмену трития с растворителем, намного выше, чем общая скорость реакции, катализируемой альдолазой. Иными словами, скорость реакции определяет преимущественно стадия конденсации [схема (64)]. Если фермент модифицировать действием карбоксипептидазы, то происходит специфическое уменьшение ферментативной активности на стадии отщепления протона и скорость определяющим процессом становится именно эта стадия. Обмен трития при этом становится незначительным, а при использовании диоксиацетона, содержащего дейтерий в положении, где идет отщепление протона, скорость общей реакции начинает зависеть от дейтериевого изотопного эффекта. С этим же модифицированным ферментом наблюдается быстрая реакция обмена карбонильного компонента реакции глицераль-дегид-З-фосфата на гексозодифосфат схема (64), стадия 2, быстрая [121]. [c.102]

Иногда таким способом образуется большое число четко различимых изоферментов так, при электрофоретическом разделении пуриннуклеозидфосфорилазы эритроцитов на электро-.фореграмме выявляется до семи симметрично расположенных компонентов [1790]. Все эти компоненты обладают ферментативной активностью, но когда активность определяют с большой точностью, иногда удается обнаружить постепенное снижение удельной активности. Такое снижение наблюдается, в частности, для глюкозо-6-фосфат— дегидрогеназы эритроцитов человека при измерении отношения активности ферментативной к иммунологической активности, причем оно сопровождается появлением новых, более отрицательно заряженных форм фермента, которые, вероятно, поэтому обладают более низкой активностью [2292]. Такой способ образования вторичных изоферментов может быть просто связан с начальными этапами деградации фермента, предшествующими полной потере активности. [c.116]

Примером может служить исследование каталазы из печени крысы. Использовав два специфических ингибитора — 3-амино-1,2 4-триазол для необратимого ингибирования каталазы и аллилизопропилацетамид для блокирования синтеза каталазы, удалось определить скорости ее синтеза и распада, правда, не независимо. Кинетику синтеза каталазы исследовали путем измерения скорости восстановления ферментативной активности после обработки фермента аминотриазолом, а кинетику распада— измеряя скорость снижения активности после об- [c.116]

Если существенный триптофанил находится вне активного центра, то сшивка изменяет баланс водородных, гидрофобных и других слабых сил (множественные разрывы связей), поддерживающих нативную конформацию макромолекулы. В результате инициируется кооперативный процесс денатурации, которая и приводит к потере ферментативной активности. В большинстве случаев непосредственной причиной инактивации являются конформационные изменения макромолекулы. Действительно, фотоинактивации белка сопутствуют конформационные перестройки и оба эти эффекта наблюдаются при одинаковых дозах УФ-света. УФ-индуцированные конформационные перестройки в белках зарегистрированы с помощью методов седиментации, электрофореза, вискозиметрии, полярографии, электронной микроскопии, люминесценции, оптического вращения, осмометрии, кондуктометрии, измерений поверхностного натяжения, растворимости, скорости дейтериевого обмена, устойчивости к протеолитическим ферментам и теплу, количества титруемых кислых, основных и 5Н-групп, изучения иммунологических свойств. [c.262]

Ферментные метки. Каким образом ферменты могут выступать в качестве маркеров иммунохимических реакций, т. е. каким образом можно детектировать ферменты и в каких минимальных количествах Попадая в раствор, молекула фермента за одну секунду может превратить определенное количество субстрата в продукт. Допустим, что фермент за секунду может образовать тысячу молекул продукта, тогда за 17 мин это количество составит миллион. Если минимальное количество продукта, которое можно обнаружить фотометрическим методом, составляет 10 молекул/мл, то это означает, что для получения такого количества продукта необходимо 10 молекул/мл фермента, т. е. 10 моль/л. Чем выше чувствительность метода, тем меньшее количество фермента может быть обнаружено. Так, например, используя хемилюминесцентный или флуоресцентный метод детекции продукта, можно определять до 10 молекул фермента в 1 мл. Фотометрические или флуоресцентные методы могут быть использованы не во всех случаях например, если измерение проводят в очень мутной среде, применяются другие методы определения ферментативной активности электрохимические, микрокалориметрические и т. д. [c.108]

Другие методики. Когда определение ферментативной активности или прямые измерения радиоактивности не подходят для контроля элюирования, следует рассмотреть другие возможности для анализа связывания. Наибольшего внимания в качестве общего чувствительного метода количественного измерения подвижного компонента заслуживает, по-видимому, радиоиммуноанализ. Кроме того, может оказаться целесообразным измерение количества элюированного подвижного компонента с помощью количественного лигандсвязывающего анализа, например в случае доступности радиоактивно меченного лиганда, аналогичного по структуре иммобилизованному лиганду. [c.232]