Нуклеиновые кислоты радиоактивный зонд

Радиоактивно меченный зонд нуклеиновой кислоты, имеющий последовательность оснований, комплементарную разыскиваемой ДНК [c.225]

Первая глава данного тома касается использования плаз-мидных векторов, имеющих в своем составе высокоспецифичные промоторы РНК-полимераз некоторых бактериофагов. Такие векторные молекулы позволяют получать радиоактивно меченные зонды, которые благодаря своим уникальным свойствам все шире применяются сейчас в исследованиях структуры и функций нуклеиновых кислот. Подобные системы на основе космидных векторов рассматриваются во второй главе. Эти векторы разработаны для того, чтобы сделать менее трудоемкими прогулки по хромосомам высших организмов. Фаговые промоторы здесь расположены таким образом, что синтезируемый радиоактивно меченный зонд соответствует концевой области клонированной ДНК, а это облегчает поиск клонов, содержащих перекрывающиеся сегменты ДНК. [c.8]

После отмывки фильтров от несвязавшегося радиоактивного зонда их высушивают и анализируют с помощью авторадиографии с использованием чувствительной к радиоактивному излучению рентгеновской пленки. Образование специфических гибридов обнаруживают после проявления рентгеновской пленки по появлению на ней четких гибридизационных сигналов в виде темных пятен, положение которых точно соответствует таковому определенных колоний или бляшек на исходной чашке Петри. В результате проведения исследования идентифицируются бактериальные колонии или фаговые бляшки, содержащие искомые рекомбинантные ДНК. С этого момента с помощью обычных микробиологических и биохимических методов можно получать неограниченное количество идентичных копий клонированной последовательности нуклеотидов ДНК для дальнейших исследований. В ряде случаев, когда нет необходимости в скрининге большого числа клонов, гибридизацию с зондами можно заменить ПЦР. При таком подходе в качестве источника матричной ДНК используют суспензию бактериальных клеток или фаговых частиц отдельных клонов без специальной очистки матричных нуклеиновых кислот. [c.163]

Где располагаются блоки сателлитной ДНК Развитие техники гибридизации нуклеиновых кислот позволило определить расположение последовательностей сателлитной ДНК непосредственно в хромосоме. При гибридизации in situ или цитологической гибридизации хромосомную ДНК денатурируют, обрабатывая клетки, распластанные на покровном стекле. Затем к препарату добавляют радиоактивный ДНК- или РНК-зонд. Зонд гибридизуется с комплементарными ему участками денатурированного генома. Расположение участков гибридизации можно определить с помощью радиоавтографии. [c.301]

На следующем этапе работы эту пленку помещают в раствор, содержащий так называемый зонд, т.е. одноцепочечные молекулы нуклеиновой кислоты, комплементарные отыскиваемым в библиотеке и содержащие радиоактивную метку. Таким радиоактивным зондом может служить информационная РНК, выделенная из ткани, в которой наиболее активно функционирует интересующий нас ген это может быть также искусственный дезоксиолигонуклеотид, синтезированный так, чтобы отвечать известной последовательности аминокислот в том белке, который кодируется разыскиваемым нами геном наконец, это может быть рестрикт из другого участка клонируемой ДНК. Радиоактивный зонд гибридизирует с комплементарной ДНК на поверхности пленки. Затем с пленки смывают не вступившие в гибридизацию остатки зонда и производят радиавтографию, позволяющую установить, где именно на поверхности пленки, а значит и на поверхности чашки Петри, располагаются негативные колонии, содержащие ДНК, способную гибридизировать с зондом (рис. 9.15). Затем из соответствующих негативных колоний можно выделить фаг, содержащий интересующий нас фрагмент чужеродной ДНК. [c.282]

Для мечения очищенных молекул ДНК радиоизотопами широко используются два метода. В первом случае в молекулу ДНК с помощью ДНК-полимеразы I Е oli вводят радиоактивно меченные нуклеотиды (рис. 4-65. А). Нри этом получают радиоактивные ДНК-зонды . используемые в реакциях гибридизации нуклеиновых кислот (см. ниже). Во втором методе фермент полинуклеотидкиназа из бактериофага [c.233]

Рис. 4-72. Методы Нозерн - и Саузерн -блоттинга. После электрофоретического фракционирования смеси молекул ДНК или РНК в агарозном геле проводят перенос различных фрагментов нуклеиновых кислот на лист нитроцеллюлозы или найлона ( блоттинг ). Этот лист затем инкубируют с радиоактивным ДНК-зондом в течение длительного времени в условиях, способствующих гибридизации. Затем лист тщательно промывают, гак что радиоактивно меченными оказываются лищь те фрагменты, которые гибридизуются с ДНК-зондом. На радиоавтографе,

В этой главе рассматриваются методы синтеза и использования в экспериментальных целях РНК, полученной in vitro с помощью РНК-полимераз фагов SP6, Т7 и ТЗ. Основное внимание мы уделили использованию радиоактивных РНК-зондов для рутинного анализа нуклеиновых кислот и не пытались изложить, кроме как в самых общих чертах, более специальные аспекты их применения, например для гибридизации in situ, в качестве смысловой мРНК или трансляционных матриц. По таким вопросам мы постарались дать ссылки на ключевые работы, которые позволят хорошо разобраться в технических возможностях этих методов. [c.12]

Эффективность гибридизации in situ зависит от следующих параметров (I) частоты встречаемости нуклеотидных последовательностей-мишеней (т. е. числа специфических последовательностей нуклеиновой кислоты, присутствующих в цитологическом препарате) (II) чистоты зонда (III) удельной радиоактивности меченого зонда (IV) чувствительности метода гибридизации (V) усиления сигнала (VI) эффективности метода радиоавтографического выявления пробы. [c.305]

Для мечения очищенных молекул ДНК радиоизотопами широко используются два метода. В пфвом случае в молекулу ДНК с помощью ДНК-полимеразы I Е соИ вводят радиоактивно меченные нуклеотиды (рис. 4-65, А). При этом получают радиоактивные ДНК-зонды , используемые в реакциях гибридизации нуклеиновых кислот (см. ниже). Во втором методе ффмент полинуклеотид киназа из бактериофага используется для пфеноса отдельных фосфатов, меченных Р, с АТР на 5 -конец каждой из цепей ДНК (рис. 4-65, Б). Поскольку каждая из цепей ДНК метится с помощью киназы только одним атомом Р, молекулы ДНК обычно недостаточно радиоактивны, чтобы использоваться в качестве зондов ДНК однако то, что помеченными цепи ДНК оказываются только по одному концу, делает их очень удобными для секвенирования и футпринтирования , что будет обсуждаться ниже. [c.233]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология