ДНК-полимераза фага

С помощью ДНК-полимеразы фага Т4 можно вводить метку и в обширные области двунитевых фрагментов ДНК, используя последовательно ее экзонуклеазную и полимеразную активности [c.179]

ДНК-полимераза фага Т4. Этот фермент обладает теми же активностями, что и кленовский фрагмент ДНК-полимеразы I. Однако 3 ->5 экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы фага Т4 существенно более эффективна, особенно на однонитевой ДНК, поэтому для введения метки в рестрикты с З -выступающими (и, конечно, ровными) концами лучше использовать эту полимеразу. Метод основан на том, что после дефадации однонитевого участка фермент в присутствии определенного нуклеотида отщепляет мономерные звенья с З -концов фрагментов до тех пор, пока в дву-нитевои ДНК не встретится одноименный нуклеотидный остаток. После этого он замещается аналогичным нуклеотидом, присутствующим в среде. В результате образуются либо ровные концы [c.179]

Корреляция между частотой мутации и экзонуклеазной активностью ДНК-полимеразы фага Т4 [11] [c.341]

Белок гена 52-высококооперативный, связывающийся с одноцепочечной ДНК и необходимый в стехиометрических количествах. Этот белок был первым охарактеризованным белком такого типа. По-видимому, он необходим для правильной геометрии репликационной вилки фага Т4, поскольку белок SSB из Е. соН не замещает его. Белок гена 32 образует комплекс с ДНК-полимеразой фага Т4 это взаимодействие, по-видимому, важно для образования репликационной вилки. [c.428]

ДНК-полимераза гена 43 обладает обычной 5 —З -синтетической активностью, связанной с 3 —З -экзонуклеазной корректирующей активностью (гл. 32.) Оставшиеся три белка отнесены к полимеразным вспомогательным белкам . Продукт гена 45 является димером. Продукты генов 44 и 62 образуют прочный комплекс, который характеризуется АТРазной активностью и тем, что он увеличивает скорость движения ДНК-полимеразы в 3 раза, от 250 до примерно 800 нуклеотидов/с последнее значение близко к скорости движения ДНК-полимеразы in vivo ( 1000 нуклеотидов/с). Увеличение в скорости не зависит от того, используется одно- или двухцепочечная матрица. В тех случаях, когда ДНК-полимераза фага Т4 работает на одноцепочечной матрице ДНК, скорость ее движения непостоянна. Фермент быстро передвигается в пределах одноцепочечных областей, однако при прохождении через области, имеющие вторичную структуру, образуемую спарившимися внутри цепи основаниями, движение его замедляется. Прохождению ДНК-полимеразы через такие участки способствуют вспомогательные белки. Их роль заключается в увеличении скорости репликации в трудных областях и, следовательно, в поддержании равномерности движения ДНК-полимеразы. Присутствие белков увеличивает сродство ДНК-полимеразы с ДНК, а также ее способность удерживаться на матричной молекуле без диссоциации. Возможно, что белки действуют как зажим , удерживая ДНК-полимеразную субъединицу на матрице более прочно. Для такого эффекта необходимо совместное действие всех трех белков. Подобный тип взаимоотношений оставляет открытым вопрос о том, что является компонентом ДНК-полимеразы, а что-вспомогательным фактором. [c.428]

Фаг кодирует одну субъединицу ДНК-полимеразы. Вторую субъединицу представляет белок бактерии-хозя-ина - тиоредоксин. Этот белок состоит из полипептида с мол. массой 12000 дальтон и используется как кофер-мент в окислительно-восстановительной реакции при восстановлении рибонуклеотидов, Его функция в качестве партнера ДНК-полимеразы фага Т7 загадочна по-видимому, она отличается от той, которую он вьшолняет в бактерии-хозяине. [c.429]

ДНК-полимераза фага Т7 использует в виде вспомогательного белка продукт фагового гена 4, в котором объединены функции раскручивания двухспиральной матрицы и синтеза РНК-затравки. ДНК-полимераза вместе с белком гена 4 способна завершить репликацию in vitro, хотя in vivo при удалении РНК-затравки в процесс может также вовлекаться экзонуклеаза, кодируемая фаговым ге- ном 6. Репликационная вилка содержит, по-видимому, в расчете на одну растущую цепь 10 молекул белка гена 4 и одну молекулу ДНК-полимеразы. Продукт гена 4 гидролизует NTP свыше того количества, которое используется в качестве субстрата для синтеза РНК. На каждое основание, включаемое в ДНК, может приходиться до четырех дополнительных гидролитических событий. Вероятно, этот гидролиз обеспечивает энергией процесс разделения цепей. [c.429]

ДНК-полимераза фага Т7. Фермент обладает 5 ->3 -полиме-разной и 3 ->5 -экзонуклеазнои активностями. Он состоит из двух субъединиц продукта гена 5 фага Т7 и вспомогательного белка тиоредоксина Е. oll. Последний повышает стабильность комплекса [c.179]

Ступенчатые концы фрагментов ДНК можно сделать ровными. Выступаюш ий З -конец можно гидролизовать нуклеазой 81 или нуклеазой из проростков золотистой фасоли. Но лучший результат достигается использованием 3 - 5 экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы фага Т4 в присутствии всех четырех [c.245]

Примечание обычно в методе рекомбинантной ДНК используется ДНК-полимераза фага Т4, чтобы затупить концы обоих типов. Концы BamHI будут затупляться в результате пришивания к ним соответствующих нуклеотидов, как показано на рис. [c.308]

Также была предложена оригинальная стратегия получения делеционных вариантов субклонов, основанная на применении все той же экзонуклеазы III [Henikoff, 1990]. Суть этой стратегии заключается в образовании сначала двуцепочечной структуры из одноцепочечного фага М13 или ему подобного и уже затем создании делеций. Так, на первом этапе проводится отжиг олигонуклеотидного праймера, расположенного таким образом, чтобы ДНК-полимеразой при удлинении праймера в первую очередь была скопирована сама векторная последовательность. Построение цепи ДНК осуществляется с помощью ДНК-полимеразы фага Т4, поскольку этот фермент характеризуется высокой скоростью полимеризации, не несет 5 — 3 -экзонуклеазной активности и не вызывает смещение цепей как некоторые другие ДНК-полимеразы. В результате образуется двуцепочечная молекула ДНК, несущая один ник между 5 -концом праймера и 3 -концом вновь синтезированной цепи ДНК. Далее в действие вступает экзонуклеаза III, работающая в обратном направлении и расширяющая ник до весьма протяженных участков одноцепочечной ДНК. Отбор аликвот данной реакции по времени расщепления приводит к формированию некоторого пула молекул с одноцепочечными участками различной протяженности. После удаления образовавшихся одноцепочечных участков S1 нуклеазой, репарации концов и их лигирования проводится трансформация компетентных клеток E. oli полученными конструкциями. Таким образом, как можно видеть из рис. 8.12, в результате всех этих процедур об- [c.259]

Разные ДНК-полимеразы осуществляют ПЦР с различной эффективностью. Так, для РоПК и ДНК-полимеразы фага Т4 степень амплификации быстро снижается, если размер амп-лифицируемого сегмента превышает 250 пн, в то время как ДНК-полимеразы Taq и фага Т7 способны с высоким выходом амплифицировать фрагменты, имеющие размер до 2000 пн. С помощью полимеразы Taq удается амплифицировать фрагменты ДНК размером не более 5 тпн. Это ограничение, по-видимому, обусловлено отсутствием у фермента корректирующей 3 -5 -экзонуклеазной активности. В ПЦР на стадии полимеризации Taq связывается с праймером и достраивает цепь на матрице. Изредка Taq ошибочно включает некомплементарный матрице нуклеотид, после чего скорость удлинения синтезируемой цепи снижается в lO -lO раз. Преодолеть эту проблему удалось, объединив Taq с другим термостабильным ферментом — полимеразой Piro o us sp. GB-D, обладающей корректирующей 3 -5 -экзонуклеазной активностью. Этот фермент может связываться с ошибочно включенным неспаренным нуклеотидом после диссоциации комплекса этого нуклеотида с полимеразой Taq и удалить его. Это позволяет [c.50]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология