Особенности денатурации циклических ДНК

Особенности денатурации циклических ДНК [c.268]

Другой интересной особенностью циклических ДНК, наблюдаемой при щелочной денатурации, является очень быстрая ренатурация при нейтрализации щелочного раствора такой денатурированной ДНК, если значение pH не превышает 12,5. При денатурации щелочью более высоких концентраций не удается добиться ренатурации (после нейтрализации) в условиях, когда ДНК II легко ренатурирует . Необратимо денатурированная ковалентно-замкнутая ДНК после нейтрализации и обработки панкреатической ДНК-зой спонтанно ренатурируетобразуя циклическую ДНК II с односпиральными разрывами данный процесс протекает значительно быстрее, чем ренатурация ДНК П. Это означает, по-видимому, что необратимая денатурация ДНК I происходит без разрыва цепей ДНК, однако в процессе денатурации они сдвигаются относительно друг друга вдоль оси спирали, после чего образование полностью комплементарной структуры при нейтрализации затруднено из-за случайного образования ненативных комплементарных пар 5 Возможно также, что воссоздание вновь исходной комплементарной структуры затруднено стерически из-за образования сверхспиральной структуры. Быстрая спонтанная ренатурация после образования единственного одноцепочечного разрыва объясняется, очевидно, тем, что при этом происходит быстрое раскручивание сверхспиральной денатурированной структуры и две цепи, находясь в непосредственной близости друг от друга, могут легко образовать полностью комплементарную двухспиральную структуру, как это происходит, например, при ренатурации денатурированной ДНК со сшивками между комплементарными цепя- [c.270]

Главное отличие циклического секвенирования ДНК от большинства описанных в предыдущем разделе, пожалуй, заключается в особенностях проведения терминирующих реакций. Так, прямое секвенирование фрагментов ДНК, полученных в ходе ПЦР, может проводиться с помощью любой ДНК-полимеразы, включая и нетермостабильную секвеназу. Причиной тому служит весьма значительное количество матрицы ДНК, позволяющей осуществить ее детекцию в секвенирующем геле. А ПЦР в данном случае просто служит для наработки необходимого количества сначала двуцепочечной, а затем и одноцепочечной ДНК. Секвенирование же ДНК с помощью так называемой линейной ПЦР осуществляется посредством циклических этапов денатурации, отжига одного праймера и удлинения цепи в условиях ее терминации дидезоксинуклеотидами, причем последние присутствуют в смеси, начиная с первого цикла (рис. 3.7). Ввиду того, что в этих случаях происходит амплификация ДНК только в арифметической прогрессии (не приводящая даже к образованию полноразмерных продуктов), то исходным материалом, несущим изначально довольно большое число копий секвенируемого фрагмента, может служить, например, ранее клонированная ДНК. С помощью всего 30 циклов становится возможным получение такого количества продуктов реакции амплификации/терминирования, которое уже будет видно после электрофоретического разделения в секвенирующем геле. [c.152]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология