Подготовка фрагментов ДНК дтя клонирования

Подготовка фрагментов ДНК для клонирования [c.241]

После получения у иммунизированной мыши четкого специфического иммунного ответа на встроенный фрагмент можно начать подготовку к проведению слияния. Несмотря на наличие многочисленных эмпирических данных о решающих факторах, от которых зависит успех слияния, оно все-таки не всегда проходит со стабильно положительным результатом, и стоит провести несколько повторных слияний. Наибольших усилий в подобных экспериментах требуют клонирование, выделение антител и их характеристика поэтому рекомендуется исследовать полученные при слиянии клоны лишь в тех случаях, когда есть много здоровых растущих клонов (100 и более). [c.187]

Самое простое правило, которым следует руководствоваться при подготовке последовательностей для клонирования в ретровирусных векторах, — уменьшение их длины до того минимума, который только необходим для экспрессии белка. Это позволит избежать непредсказуемых трудностей сопряженных с экспрессией или лабильностью системы. В любом случае вставка должна быть достаточно мала, чтобы суммарный размер геномной РНК, предназначенной для упаковки, не превышал 10—И т. п. н. [14]. Идеальным можно считать фрагмент ДНК, включающий полную открытую рамку считывания с о - и З -фланкирующими последовательностями, которые были бы как можно более короткими. Особое внимание следует уделить элиминации последовательностей, влияющих на транскрипцию или процессинг РНК, — таких, как промоторы или сигналы полиаденилирования. Добавочные кодоны AUG выше предполагаемой точки начала трансляции также нежелательны, так [c.286]

Щелочные фосфатазы бактерий (ВАР) и кишечника теленка ( IAP) катализируют удаление 5 -фосфатных групп ДНК или РНК, а также расщепление макроэргических связей рибо- и дез-оксирибонуклеозидтрифосфатов. Их используют при подготовке фрагментов нуклеиновых кислот к введению З -концевой радиоактивной метки З2р а также для предотвращения лигирования векторных молекул ДНК самих на себя. Как уже упоминалось выше, ДНК-лигаза способна образовывать фосфодиэфирные связи в одноцепочечных разрывах лишь при наличии в них 5 -концевого фосфата. Удаление 5 -концевых фосфатных групп молекул вектора, линеаризованных с помощью одной рестриктазы во время подготовки его для клонирования соответствующего фрагмента ДНК, предотвращает образование кольцевых молекул вектора (без вставки), а также его олигомеров во время лигирования с клонируемой последовательностью. Необходимые для лигирования со вставкой фосфатные группы содержатся в самих клонируемых фрагментах ДНК, а остающиеся в результате неполного лигирования два одноцепочечных разрыва репарируются in vivo после введения вектора со вставкой в бактериальные клетки. Гены секретируемых щелочных фосфатаз находят применение и в качестве высокочувствительных генов-репортеров при исследовании функционирования регуляторных элементов различных генов в прокариотических и дрожжевых системах экспрессии, а также в клетках млекопитающих [91]. [c.65]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология