Другие дрожжевые системы экспрессии

Другие дрожжевые системы экспрессии [c.140]

Дрожжевые системы экспрессии стали играть важную роль в получении гетерологичных белков для научных, промыщленных и медицинских целей. Однако, как показали исследования, ни одна из них не может гарантировать получение аутентичного белка любого гена. По этой и ряду других причин были разработаны системы экспрессии генов с использованием клеток насекомых и млекопитающих. [c.143]

Альтернативные методы скрининга космидных библиотек, описанные в гл. 3, предполагают селекцию космидных клонов с использованием феномена гомологичной рекомбинации in vivo. Остальные главы книги посвящены вопросам, связанным с экспрессией клонированных генов. Для многих белков млекопитающих удалось осуществить высокопродуктивную внутриклеточную экспрессию в Е. oli. Однако гетерологические белки, локализующиеся в цитоплазме, часто образуют трудно растворимые агрегаты, что значительно осложняет получение нативного продукта. В гл. 4 описаны эффективные способы выделения активных растворимых продуктов из нерастворимых белков цитоплазмы Е. соИ. Вероятность деградации специфическими бактериальными протеиназами многих эукариотических белков, синтезируемых в Е. oli, может быть существенно снижена, если их экспрессировать в виде гибридных белков. Такие составные белки, в которых бактериальный компонент обычно представлен -галактозидазой, можно использовать в качестве иммуногенов для получения антисыворотки и моноклональных антител к клонированному эукариотическому белковому домену. Эти вопросы >ассматриваются в двух главах — одна посвящена получению поликлональной антисыворотки, а другая — методам гибридной технологии. В последующих главах книги описаны современные эукариотические экспрессирующие системы в гл. 7 — дрожжевая, далее в трех главах — системы на основе культивируемых клеток млекопитающих и трансгенные животные. В частности, описана система экспрессии с использованием векторов, которые несут гены, обеспечивающие возможность их индуцибельной амплификации это позволяет снимать токсическое действие антибиотиков, введенных в культуральную среду. Клонированные в таком векторе гены также [c.8]

Помимо цитсплазматической экспрессии дрожжевые системы позволяют секретировать гетерологичные белки в культуральную среду. Существует несколько причин, по которым секреция белкового продукта оказывается предпочтительной. Многие из человеческих белков, представляющих терапевтический интерес, секретируются клетками одних типов, тогда как действие их направлено на другие клетки. Эти белки часто бывают богаты цистеином, а множественные дисульфидные связи как раз служат основным препятствием для успешной ренатурации полипептидов, продуцируемых Е. oli. [c.209]

На основе Sa haromy es erevisiae созданы высокоэффективные системы экспрессии рекомбинантных генов и крупнотоннажного синтеза рекомбинантных белков человека, животных и растений, в том числе и рекомбинантных антител (см. раздел П.3.4) [257]. Кроме того, экспрессия рекомбинантных белков в этих клетках активно используется для улучшения свойств белков методами направленной эволюции с использованием клеточного дисплея (раздел П.2.3.2), изучения белок-белковых взаимодействий в дрожжевых л-гибридных системах (раздел П.2.3.4) и для множества других не менее важных целей. [c.174]

Какого бы типа векторные плазмиды ни использовались, для эффективного инициациирования тракскрипции необходимо, чтобы в их составе присутствовал дрожжевой промотор. Чаще всего используют гликолитические промоторы. Поскольку ферменты гликолиза, несмотря на то что они кодируются уникальными генами, составляют от 1 до 5% суммарного клеточного белка, можно было предположить (и зто оказалось верно), что промоторы соответствующих генов относятся к разряду сильных промоторов. Другое необходимое условие успешной экспрессии — это эффективное терминирование транскрипции. Дрожжевые клетки обычно узнают терминаторные последовательности млекопитающих, однако с точки зрения оптимизации системы имеет смысл ввести в вектор дрожжевой терминатор (рис. 7.1). Промотор и терминатор разделены уникальным сайтом рестрикции, что позволяет реализовать стандартный путь создания рекомбинантной конструкции с интересующим структурным геном. [c.215]

Варианты системы Y2H. Разработан ряд вариантов основной дрожжевой дигибридной системы, использующихся для отбора мутантных белков, взаимодействие между которыми нарушается в результате мутаций. В системе, получившей название обратной Y2H, для отбора белков с нарушенным взаимодействием применяют GaI4 DBD и AD, а также ген-репортер URA3 в качестве контр-селектируемого маркера (рис. 50, а). В такой системе вначале подтверждают взаимодействие между исследуемыми белками, выращивая клетки в отсутствие урацила, а затем отбор веществ, нарушающих взаимодействие между белками, проводят в присутствии 5-F0A. Клетки выживают лишь в том случае, если исследуемые белки в результате внешнего воздействия перестают взаимодействовать друг с другом, и экспрессия гена URA3 прекращается. [c.362]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология