Инсерционные мутанты

Исследование гетеродуплексных молекул, образованных ДНК мутанта и ДНК дикого типа, показало, что инсерционные мутанты содержат участки ДНК, встроенные в молекулу ДНК дикого типа (рис. 8.11). Было обнаружено, что несколько различных встраивающихся последовательностей могут вызывать мутации многих генов. Некоторые свойства наиболее известных из этих последовательностей представлены в табл. 8.1. Они различаются размером, но имеют некоторые общие черты строения. На концах содержатся одинаковые или почти одинаковые нуклеотидные последовательности, расположенные, однако, в обратном порядке. В случае IS1, например, концевые последовательности содержат по 23 нуклеотида, 18 из которых одинаковы для обоих [c.241]

Заслуживает внимания то, каким образом возникают такие мутанты со вставками (инсерционные мутанты), так как они появляются с высокой частотой, хотя уровень мутагенеза, которому подвергаются клетки, оказывается чрезвычайно низким. Каждый из выделенных мутантов возникает в результате одного и только одного мутационного акта. По этой причине не происходит выделения мутантов с множественными повреждениями и таким образом обходится затруднение, возникающее при интенсивной химическом мутагенезе. [c.19]

Выращивание трансдуцирующего фага на пуле инсерционных мутантов [c.25]

Рис. 6.1. Схемы конструирования делеционных и инсерционных (вставочных) мутантов

Мутации, вызываемые транспозонами. В генетике бактерий все большее значение приобретает метод получения мутаций с помопдью транс-позонов. Транспозоны (Тп) представляют собой короткие двойные цепи ДНК, которые состоят из более чем 2000 пар оснований и обычно обусловливают устойчивость к одному антибиотику, в исключительных случаях-к нескольким, Транспозоны способны перепрыгивать из одного участка генома в другой, в частности из бактериальной хромосомы в плазмиду и обратно таким образом, они могут включаться в различные участки генома (см. разд. 15.3,1), В случае внедрения транспозо-на в какой-либо структурный ген хромосомы нуклеотидная последовательность этого гена будет нарушена и генетическая информация не сможет транслироваться в функционально полноценный полипептид. ВЬзникнет инсерционный мутант. [c.447]

Транспозирующиеся элементы были открыты при обнаружении вставок (инсерций) нового материала в пределах бактериальных оперонов. Такие вставки локализуются внутри гена и предотвращают его транскрипцию и (или) трансляцию. Кроме того, они могут проявлять полярный эффект, выражающийся в уменьшении степени экспрессии следующих за ними генов оперона. Первоначально определенные как негативные мутации, вставки були идентифицированы благодаря тому, что в отличие от точечных мутаций единственной формой реверсий для них является делетирование встроенного материала. При сравнении последовательностей, присутствующих в различных инсерционных мутантах, оказалось возможным классифицировать несколько дискретных элементов. Каждый тип элемента мог быть встроен в любой ориентации в определенный сайт. [c.459]

Мобильные элементы у эукариот. Как уже указывалось, мобильные элементы впервые были обнаружены у кукурузы. Впоследствии их нашли и у других эукариот, например у дрозофилы [365]. У этого организма инсерционные мутанты возникают с высокой частотой и несут вставки в определенных специфических локусах. Существует три источника мобильных элементов у дрозофилы а) они могут происходить из генных последовательностей, рассеянных по всему геному. Показано, что некоторые элементы из этих генных последовательностей действительно способны перемещаться б) вторым возможным источником мобильной ДНК могут быть повторяющиеся последовательности конститутивного гетерохроматина прицентромерных районов хромосом в) в качестве источника мобильных элементов могут выступать и РНК-вирусы, паразитирующие на дрозофиле. В этом случае с помощью обратной транскриптазы (разд. 2.3.2.2) вирусная РНК транскрибируется в ДНК, а последняя способна встраиваться в геном. [c.141]

Набор клонов со случайными транспозициями ТпЮ получают в точности так, как это описано в эксперименте 1. Смещи-вают примерно 2000—5000 таких клонов и на такой смеси инсерционных мутантов бактерий выращивают фаг, осуществляющий неспецифическую трансдукцию. Затем полученным препаратом фага трансдуцируют какой-нибудь мутант па интересующей области. Проводят отбор клеток, у которых восстановлена мутантная функция (в данном случае отбирают клетки с замещенной областью ригВ). Каждый трансдуцированный фрагмент получен от донорной клетки, которая в какой-то точке хромосомы содержала ТпЮ. Вероятность того, что переданный при трансдукции фрагмент хромосомы донора с геном ригВ+ получен от клетки со вставкой ТпЮ, находящейся вблизи этой интересующей нас области, оказывается вполне удовлетворительной (около 0,01). В этом случае элемент ТпЮ может наследоваться вместе с селектируемой областью. В действительности от [c.24]

Дважды промойте культуру собранных вместе инсерционных мутантов со вставками. Для этого два раза отцентри-фугируйте клетки, ресуспендируя их в среде Е. Промытой суспензией засейте 1,0 мл бульона LB, чтобы получить препарат лизата трансдуцирующего фага Р22 (см. методику 3). Остаток промытого пула инсерционных мутантов сохраните. [c.25]

Принципы конструирования инсерционных мутантов сходны с описанными выще для делеционных мутантов. Клонированный сегмент ДНК расщепляют по одному из сайтов с помощью рестриктирующей эндонуклеазы или неспецифической эндонуклеазы. При необходимости заполняют пробелы на концах образовавщейся линейной молекулы или отщепляют одно цеп очечные хвосты с помощью нуклеазы и осуществляют лигирование в присутствии сегмента, который хотят встроить в молекулу. В качестве вставки может использоваться синтетический фрагмент, содержащий множество сайтов для рестрикционных эндонуклеаз, — так называемый полилинкер. Если первое расщепление было ш пе-цифичным (например, если оно было осуществлено [c.344]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология