Кишечная палочка ДНК-лигаза

Первый прием был популярен на заре генной инженерии, в середине 70-х годов, когда в плазмиду встраивали, в основном, гены кишечной палочки или других бактерий. Он совсем прост. ДНК, один из генов которой хотят встроить, случайным образом дробят на куски. При этом даже не обязательно использовать рестриктазы. Затем такую случайно нарубленную ДНК примешивают к плазмиде, разрезанной рестриктазой в одном месте, и добавляют лигазу. Разные плазмидные молекулы захватывают разные куски ДНК, так что в результате получается масса различных плазмид. Весь этот винегрет добавляют к бактериальным клеткам. [c.62]

Представление о том, что носителем генетич. информации является ДНК, возникло еще в 1944. Было известно также, что ген представляет собой отрезок ДНК, кодирующий определенный белок, и что передача наследств. ин(]юр-мации между поколениями происходит посредством удвоения молекул ДНК. Но любым манипуляциям препятствовала огромная молекулярная масса ДНК, составляющая миллионы и миллиарды иа клетку, и невозможность получать химически однородные небольшие ее фрагменты. Положение изменилось, когда удалось обнаружить и выделить два рода ферментов 1) рестриктирующие эндонуклеазы (рестриктазы)-они рассекают молекулы ДНК в пределах строго определенных нуклеотидных последовательностей их описано ок. 400, наиб, употребительны рестриктазы E o RI, Hind III, Bam HI, Pst I, Sal I и др. 2) ДНК-лигазы (прежде всего фермент кишечной палочки, индуцируемый бактериофагом Т4), к-рые сшивают двухцепочечные фрагменты ДНК, восстанавливая межнуклеотндные связи в местак единичных разрывов. С помощью этих ферментов получают удобные для генетич. операций фрагменты ДНК и соединяют их в единое целое. Для такого объединения безразлично происхождение ДНК (химически у всех существ она одинакова), между тем в природе объединению генетич. информации неродственных существ препятствуют разл. межвидовые барьеры. [c.518]

Опыты Уонга требовали времени и усилий надо было в зкДНК разрывать одну из нитей, создавать комплекс между белком и разорванной ДНК, затем залечивать разрыв лигазой, отделять ДНК от белка и, наконец, измерять величину сверхспирализации. Хорошо бы иметь один белок, который и рвет нить, и залечивает разрыв, думал Уонг. Насколько меньше было бы возни. И он принялся искать такой белок в клеточных экстрактах кишечной палочки. [c.93]

Отметим прежде всего синтез двухцепочечной ДНК, длина которой соответствует 77 звеньям тРНК дрожжей. При этом использовался фермент ДНК-лигаза, получаемый из фага Т4 кишечной палочки. [c.187]

Рис. 6.12. Структура тРНК " кишечной палочки. Указаны соответствующие олигонуклеотиды. Пунктиром отмечены места сшивания РНК-лигазой.

ДНК-лигазы — ферменты, катализирующие репарацию одноцепочечного разрыва, который обычно возникает под влиянием эндонуклеаз. Поэтому ДНК-лигазы называют еще исшивающими ферментами. Лигазы обнаружены в самых различных клетках, в том числе и в клетках, зараженных вирусами. Под влиянием этих ферментов образуются фосфодиэфирные связи между свободным 5 -фосфатным концом олнго- или полинуклеотида и З -гидроксильной группой соседнего олиго- или полинуклеотида. Скорее всего реакция протекает с обязательным образованием промежуточного комплекса лигазы с АМФ. Например, в клетках кишечной палочки такой комплекс образуется при взаимодействии лигазы с НАД, а в клетках млекопитающих такой комплекс образуется при взаимодейЛвии лигазы с АТФ. Предположительно схему действия ДНК-лигаз можно показать так (рис. 13) Катализируемые ДНК-лигазой ре- [c.51]

Модель Кэрнса объясняет механизм репликации кольцевой ДНК- Согласно этой модели удвоение всегда начинается с одной и той же точки и идет всегда в одном направлении с помощью своеобразного шарнирного механизма шарнир расположен в стартовой точке и дает возможность свободно вращаться неудвоенной части молекулы. Первоначально модель Кэрнса основывалась на радиоавтографических данных, свидетельствовавших о существовании репликационной вилки Шарнир может возникнуть в результате поочередного действия эндонуклеазы и лигазы, разрывающих и вновь соединяющих кольцевую молекулу ДНК. Радиоавтографические данные Кэрнса можно объяснить двумя вилками, которые движутся от общего начала в противоположном направлении. Такой двунаправленный синтез ДНК обнаружен в клетках кишечной палочки и подтверждается методами генетического анализа. Несмотря на то, что проблема раскручивания ДНК продолжает оставаться дискуссионной, все же результаты исследований указывают на то, что каждая из исходных цепей ДНК полностью сохраняется в течение всего периода репликации. [c.60]

Кроме ДНК-полимераз, обладающих у прокариот к тому же нуклеазной активностью, в биосинтезе ДНК принимает участие ДНК-лигаза. Она открыта в 1967 г. одновременно в пяти лабораториях. Это белок с М = 96000. В клетке кишечной палочки, например, насчитывается около 2000 молекул ДНК-лига-зы. Ее функция состоит в обеспечении каталитического ускорения реакции образования фосфодиэфирной связи между 3 - и 5 -концами цепей ДНК, сближенных на расстояние одного нуклеотидного звена и закрепленных на комплементарной им, но непрерывной другой цепи ДНК. Такая ситуация возникает во многих случаях при устранении разрывов в одной из цепей ДНК, вызванных облучением, действием нуклеаз и т.п. при соединении новообразованного при репарации или в процессе нормальной репликации фрагмента с предшествующими или вновь созданными при этом фрагментами ДНК при ковалентном замыкании линейной молекулы ДНК в кольцевую структуру и т. п. Механизм ДНК-лигазной реакции представлен на рис. 84. ДНК-лигаза нашла применение в работах по синтезу генов и их фрагментов. [c.251]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология