Плазмидные ДНК

Рис. 4.8. Встраивание чужеродной ДНК в плазмидный вектор. Плазмидную ДНК, обработанную рестриктазой и щелочной фосфатазой, смешивают с рестрицированной донорной ДНК, содержащей нужный ген, и добавляют ДНК-лигазу. Два из четырех одноцепочечных разрыва при этом устраняются, и конструкция оказывается стабильной благодаря образовавшимся фосфодиэфирным связям. После введения гибридной ДНК в клетку-хозяина происходит ее репликация и образуются новые кольцевые молекулы уже без разрывов.

Зачем рестрицированную плазмидную ДНК перед лигированием часто обрабатывают щелочной фосфатазой [c.79]

Рекомбинантная ДНК проникает в клетки бактерий, характеризующихся низкой частотой трансформации, таким же образом, как плазмидная ДНК из донорской клетки в реципиент-ную в естественных условиях. Некоторые плазмиды обладают способностью создавать межклеточные контакты, через которые они и переходят из одной клетки в другую. Образование контактов между донорной и реципиентной клетками обеспечивается конъюгативными свойствами плазмид, а сам перенос ДНК - мобилизационными. Большинство плазмид, которые используются в работах с рекомбинантными ДНК, не обладают конъюгативными функциями и поэтому не могут переходить в реципиентные клетки путем конъюгации. Однако проникновение в клетку некоторых плазмидных векторов все-таки происходит при наличии в этой клетке второй плазмиды, обладающей конъюгативными свойствами. Таким образом, введя в клетку, несущую мобилизуемый плазмидный вектор, плазмиду с конъюгативными функциями, можно трансформировать клетки-реципиенты, с трудом поддающиеся трансформации другими способами. [c.77]

Для отбора клеток, содержащих рекомбинантную ДНК, используют специальные приемы. Чтобы уменьшить количество кольцевых плазмидных молекул, образующихся ири сшивании фрагментов ДНК-лигазой Т4, рестрицированную плазмидную ДНК обрабатывают щелочной фосфатазой, удаляющей 5 -концевые фосфатные группы. Для отбора трансформированных клеток, содержащих гибридные плазмиды, проводят 1) тестирование на резистентность к определенным антибиотикам или колориметрическую реакцию 2) иммунологические тесты или выявление специфического белка - продукта клонированного гена 3) гибридизацию с зондом, комплементарным како-му-либо участку искомого гена. [c.78]

Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием плазмидной ДНК Основной недостаток олигонуклеотид-направ-ленного мутагенеза с использованием фага М13 -большое число процедур. Чтобы выделить мутантную форму нужного гена, приходится затратить много времени. В качестве альтернативы системе с использованием фага М13 было разработано множество других подходов, основанных на применении плазмидных ДНК. Это позволяет обойтись без переноса Интересующего исследователя гена из плазмиды в фаговую ДНК, а после завершения мутагенеза - обратно в плазмиду. Один из этих подходов включает встраивание ДНК в плазмидный вектор, который несет функциональный ген устойчивости к тетрациклину и неактивный ген устойчивости к ампициллину в середине последнего заменен один нуклеотид (рис. 8.3). Клетки Е. соИ трансформируют вектором, несущим ДНК-мишень, и двухцепочечную плазмидную ДНК денатурируют щелочью с тем, чтобы получить одноцепочечные кольцевые молекулы. Денатурированную ДНК отжигают с тремя разными олигонуклеоти- [c.161]

Транспозонами (Тп-элементами) называют сегменты ДНК, обладающие теми же свойствами, что и IS-эле.менты, но содержащие кроме того, гены, не и.меющие непосредственного отношения к транспозиции. Транспозоны могут нести гены устойчивости к антибиотикам, гены токсинов или гены дополнительных фер.ментов клеточного метаболизма. В общем, для транспозонов характерны те же гены, которые встречают в плазмидах. Более того, нередко присутствие в составе плазмиды того или иного гена обусловлено наличием в последовательности плазмидной ДНК соответствующего транспо-зона (см. раздел 3 этой главы). Транспозон может быть устроен так же, как IS-элемент, но с дополнительным геном. Однако важно отметить, что часто два IS-элемента, оказавшиеся поблизости друг от друга, способны перемещаться вместе, одновременно перенося заключенный между ними сегмент ДНК- Таким образом, два расположенных рядом lS-эле.мента могут образовать транспозон. Транс- [c.113]

А. Поскольку для переноса плазмидной ДНК должна произойти-конъюгация между тремя бактериальными штаммами, эта процедура получила название тройного скрещивания. [c.77]

Кольцевая плазмидная ДНК с одноцепочечными разрывами и [c.164]

Из трансформированных клеток, выросших в жидкой селективной среде (т. е. из клеток, содержащих плазмиду), вьщеляют плазмидную ДНК. [c.248]

Трансформируют Е. соИ плазмидными ДНК, обработанными эндонуклеазой рестрикции. [c.248]

Известно неск. типов РНК. Рибосомные рибонуклеиновые кислоты, связываясь с рибосомными белками, образуют рибосомы, в к-рых осуществляется синтез белка. Матричные рибонуклеиновые кислоты служат матрицами для синтеза белков (трансляции). тРНК осуществляют связывание соответствующей аминокислоты и ее перенос к рибосомам. Обнаружены т.наз. малые ядерные РНК, участвующие в превращ. первичных продуктов транскрипции в функционирующие молекулы т.наз. антисмысловые РНК участвуют в регуляции биосинтеза белка и репликации плазмидных ДНК. В виде РНК представлены геиомы мн. вирусов (РНК-содержащие вирусы), в к-рых матрицами для синтеза РНК служат вирусные РНК. Нек-рые РНК обладают ферментативной активностью, катализируя расщепление и образование фосфодиэфирных связей в своих собственных или др. молекулах РНК. [c.298]

Ключевым моментом этого метода является то, что плазмидная ДНК клонов, несущих и экспрессирующих ген фермента модификации, оказывается устойчивой к расщеплению соответствующей эндонуклеазой рестрикции, поскольку сайты узнавания в ней метилированы. [c.248]

У некоторых бактерий, в особенности грамположительных, существует процесс естественной трансформации (см. раздел 4 этой главы). Находясь в особом, ко.мпетентно.м, состоянии, эти бактерии способны получать ДНК, оказавшуюся в среде (напри.мер, ДНК из погибших клеток), в частности плазмидную ДНК. Это еще один путь перемещения плазмид из клетки в клетку. При трансформации грамположительных бактерий в клетку проникает лишь одна линейная цепь ДНК. Поэтому для восстановления кольцевого плаз- [c.111]

Рассмотрим теперь совсем недавний пример разделения ДНК и РНК. Здесь решалась более тонкая задача разделения НК, соизмеримых по своим размерам, а именно очистки ДНК плазмиды pBR 322 от примеси РНК. Присутствие РНК в препаратах плазмидной ДНК мешает протеканию некоторых ферментативных реакций и затемняет результаты введения концевой радиоактивной метки. Оказалось, что даже интенсивная обработка РНКазой (50 мкг/мл, 37°, 1 ч) не расщепляет РНК полностью, а лишь дробит ее на фрагменты, не обнаруживаемые электрофорезом в 1%-ном геле агарозы (они уходят вперед), но переосаждающиеся этанолом вместе с плаз-мидной ДНК. Кроме того, обработка РНКазой вообще нежелательна. Несмотря на предварительный прогрев, в ней остается небольшая [c.143]

ДЫКазная активность, вызывающая разрывы в ДНК плазмиды (возможно, что разрывы происходят по коротким вставкам РНК в молекулах ДНК, но это не меняет дела). ДНК плазмиды очищали, как обычно, центрифугированием просветленного лизата и ультрацентрифугированием в градиенте СзС с иодистым пропидием, потом удаляли последний многократной экстракцией бутанолом. ДНК дважды переосаждали подкисленным этанолом и в конце концов получали препарат, содержавший, помимо плазмидной ДНК, от [c.144]

Рис. 75. Очистка плазмидной ДНК от РНК гель-фильтрацией на колонке сефакрила 8-300

Очистку плазмидной ДНК от примеси РНК (после осаждения ДНК бактерии-хозяина из просветленного лизата ) можно осуществлять в препаративном варианте на колонке оксиапатита и без участия бромистого этидия, но в присутствии 8 М мочевины, что обеспечивает сохранение однонитевой структуры РНК. Окси-апатит (1 г на 1 л лизата бактерий) суспендировали в 0,2 М Na-фосфатном буфере (pH 6,8) с добавлением до 8 М мочевины и заполняли им широкую колонку. Освобожденный от ДНК хозяина лизат без какой-либо дополнительной очистки разбавляли в соотношении 9 1 0,27 М Na-фосфатным буфером (pH 6,8) с 9 М мочевиной и 0,9% ДДС-Na и вносили в колонку. Ее промывали сначала тем же раствором, но без ДДС-Na, потом 0,01 М Na-фосфатным буфером без мочевины (при этой промывке сорбент один раз взмучивали и снова давали ему осесть). Все белки и РНК выходили из колонки в ходе промывок. Плазмидную ДНК элюировали 0,3 М Na-фосфатным буфером. По данным авторов, ее выход сильно варьировал от одной партии оксиапатита к другой. Из больших объемов бактериальных лизатов все нуклеиновые кислоты целесообразно сначала осадить этанолом. Показано, что разрывы в плазмидной ДНК в ходе очистки на оксиапатите не появляются [ olman et al., [c.239]

Джонсон и Илан недавно отметили, что методика Колман и соавторов дает не всегда воспроизводимые результаты и загрязнения плазмидной ДНК белком и РНК в некоторых случаях оказываются значительными. Они ввели в эту методику промывку колонки с сорбированной на ней ДНК 0,35 М Na-фосфатным буфером (вместо 0,27 М) в присутствии 6 М мочевины. Такая промывка надежно удаляет РНК и белок. Они также показали возможность очистки на оксиапатите высокомолекулярной ДНК фага X. Оказалось, что в присутствии 8 М мочевины эта ДНК сорбируется на нем обратимо [Johnson, Пап, 1983]. [c.239]

Принцип метода иллюстрирует рис. 148. Фрагмент ДНК, по которому ведется отбор, например содержащий определенный ген, встраивают и размножают в плазмиде. Очищенные плазмиды дробят ультразвуком или линеаризируют действием рестриктаз, а затем меркурируют, как описано выше. Фрагментированные ДНК или РНК, из которых надлежит отобрать комплементарные участки, гибридизуют с ДНК меркурированных плазмид в условиях, когда последняя находится в избытке. Гибридные молекулы (вместе с молекулами ренатурпрованной плазмидной ДНК) вносят на колонку SH-сефарозы. При этом нити плазмидной ДНК через атомы ртути ковалентно связываются с сорбентом (на рис. 148 для ясности он изображен в виде ааштрихованных полосок у стенок колонки, тогда как в действительности он заполняет весь ее объем). Промывка колонки удаляет из нее не вошедшие в состав гибридов, т. е. пе комплементарные к плазмидной ДНК фрагменты нуклеиновых кислот. Затем следует элюция 97 %-ным формамидом нри повышенной темнературе. Двунитевые структуры диссоциируют, и очищенные комплементарные участки ДНК или РНК, не будучи связанными с матрицей, выходят из колонки. Остающуюся в колонке меркурированную плазмидную ДНК можно снять, как обычно, элюцией -меркаито-этанолом. [c.438]

Рис. 8.4. Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием ПЦР. Реакцию проводят в двух пробирках, в каждой из которых содержится одинаковая двухцепочечная плазмидная ДНК, но разные наборы праймеров. Праймеры 1 и 3 содержат один неспаривающийся нуклеотид и комплементарны разным цепям плазмидной ДНК. Праймеры 2 и 4 полностью комплементарны соответствующим участкам плазмидной ДНК и тоже гибридизуются с разными цепями. Положение сайтов гибридизации для праймеров каждой пары различается, но их концы стыкуются. В результате ПЦР-амплификации образуются линейные молекулы. По окончании реакции содержимое пробирок смещивают и проводят денатурацию, а затем ренатурацию. В результате кроме двух исходных линейных амплифицированных молекул образуются две кольцевые плазмидные ДНК, каждая с двумя одноцепочечными разрывами. После трансформации кольцевыми молекулами клеток Е. соН разрывы репарируются ферментами клетки-хозяина, и плазмида может реплицироваться независимо. Линейные молекулы ДНК в Е. oli не сохраняются.

В бактерии посредством Т. можно ввести также ДНК плазмид. Конечным результатом этого является возникновение клетки, несущей чужеродную плазмиду в автономном состоянии или включенную в состав хромосомы. Механизм проникновения в клетку плазмидной ДНК такой же, как и хромосомной. Однако возникновение однонитевой ДНК и др. процессы, сопутствующие поглощению, настолько уродуют плазмиды, что вероятность правильного восстановления кольцевой реплицирующейся формы низка (Т. клетки мономерными формами плазмид не эффективна). Поэтому употребляют мультимерные (состоящие из неск. плазмид) формы или плазмиды с прямыми повторами нуклеотидов, отчего шансы на сборку полноценной плазмиды повышаются. [c.626]

Некоторые бактериальные плазмиды (обычно достаточно крупные) способны передаваться из одной клетки в другую, иногда даже в клетку другого вида бактерий (как правило, не слишком далекого). Такие плазмиды называются трансмиссивными, и их свойства определяются группой генов, ответственных за перенос (гены 1га). Трансмиссивные плазмиды кодируют специальные ворсинки, половые пили, которые появляются на поверхности клеток, содержащих плазмиды, и способны специфически связываться с поверхностью бесплазмидных клеток. Последующее сокращение пиля притягивает клетки друг к другу и между ними образуется мостик, через который плазмидная ДНК может передаться в новую клетку. /т-Гены разных плазмид часто сходны между собой. [c.111]

Трансформация — это процесс введения свободной ДНК в бактериальную клетку. Е. соИ используется в качестве организма-хозяина при работе со многими рекомбинантными ДНК, и чтобы обеспечить проникновение в клетки плазмидной ДНК, их обрабатывают ледяным раствором СаСЦ, а затем вьщерживают при 42 °С в течение 1,5 мин. По-видимому, в результате такой обработки происходит локальное разрушение клеточной стенки. Этот метод дает максимальную частоту трансформации, примерно 10 , т. е. на каждую 1000 клеток приходится одна трансформированная. Эффективность трансформации, которая определяется как число трансформантов на 1 мкг добавленной ДНК, составляет примерно 10 —10. Частота трансформации никогда не бывает 100-процентной, но этот недостаток компенсируется применением схем отбора, позволяющих быстро идентифицировать трансформированные клетки. [c.76]

М 13-векторов, содержащих перекрывающиеся субклонированные последовательности, значительно увеличивается. Чтобы решить эту задачу, были разработаны методы секвенирования двухцепочечных плазмидных ДНК, не требующие субклонирования. Плазмидную ДНК, содержащую нужную вставку, вьщеляют и отжигают с синтетическим олигонуклеотидным праймером, который гибридизуется с последовательностью в одной из цепей векторной ДНК, находящейся вблизи вставки. Затем осуществляют дидезокси-секвенирование, позволяющее идентифицировать первые 250-350 нуклеотидов вставки. Исходя из этих данных синтезируют второй олигонуклеотидный праймер, комплементарный сегменту вставки, отстоящему примерно на 300 нуклеотидов от места связывания первого праймера, и секвенируют следующие 250-350 нуклеотидов. Аналогичным образом синтезируют третий праймер и определяют нуклеотидную последовательность следующих 250—350 нуклеотидов (рис. 5.17). Эту процедуру, называемую праймер-опосредованной прогулкой, продолжают до тех пор, пока не секвенируют весь фрагмент. Аналогичным образом секвенируют вторую цепь, начиная с праймера, который гибридизуется с этой цепью вблизи вставки. [c.93]

Другой подход основан на использовании синтетических ориентированных адапторов — коротких олигодезоксинуклеотидов, присоединенных к концам линеаризованной плазмидной ДНК и к концам фрагментов ДНК с клонируемым геном. При лигировании эти фрагменты располагаются только в одной ориентации. Описанная процедура технически значительно более проста, чем та, в которой используется рестрицирующая эндонуклеаза Aval кроме того, она не требует, чтобы в гене-мишени отсутствовали Aval- и соШ-сайты. [c.118]

Если клетка трансформирована нереплици-рующейся плазмидой, несущей клонированный ген в середине клонированного фрагмента с хромосомным сайтом интеграции, то может произойти спаривание между гомологичными нуклеотидными последовательностями плазмиды и хозяйской ДНК (рис. 6.15, А) и далее интеграция в результате двойного кроссинговера, осуществляемого ферментами клетки-хозяина. Альтернативный вариант — интеграция всей плазмидной ДНК в хромосому хозяина в результате одиночного кроссинговера (на рисунке не показано). Интеграция всей плазмиды может произойти и в том случае, если клонированный [c.123]

Рис. 8.3. Олигонуклеотид-направлен-ный мутагенез с использованием плазмидной ДНК. Ген-мишень встраивают в полилинкер вектора pALTER. Плазмидную ДНК денатурируют в щелочи и отжигают с тремя олигонуклеотидами мутагенным олигонуклеотидом, олигонуклеотидом, восстанавливающим устойчивость к ампициллину (Amp ), и олигонуклеотидом, придающим чувствительность к тетрациклину (Tef ). Эти олигонуклеотиды служат затравками для синтеза ДНК с помощью ДНК-по-лимеразы Т4, а исходная цепь - матрицей. Одноцепочечные разрывы в новосинтезированной цепи зашиваются ДНК-лигазой Т4. Продуктами реакции трансформируют клетки Е. соН и отбирают трансформантов Amp и Tet.

Опищите стратегию олигонуклеотид-направленного мутагенеза с использованием плазмидной ДНК. [c.177]

Векторы на основе бактериофага X не очень пригодны для получения больших количеств белковых молекул. Чтобы решить эту проблему, сконструировали такой вектор, в котором ДНК Н-и L-цепей встраиваются в сайт, фланкированный плазмидной ДНК. Такую плазмиду, содержащую ДНК Н- и L-цепи, можно вырезать из вектора и трансформировать ею Е. oli (рис. 10.12). Являясь частью плазмиды, ДНК Fv-фрагментов будет многократно реплицироваться в клетках Е. соИ с образованием большого количества продукта, который можно использовать как в диагностическгк, так и в терапевтических целях. [c.219]

Рис. 11.5. Выживание мышей, иммунизированных вирусной ДНК. Тестируемых мышей иммунизировали Е. со//-плазмидой, несушей кДНК нуклеопротеина вируса гриппа А под контролем промотора вируса саркомы Рауса. Контрольным мышам вводили только плазмидную ДНК. По оси абсцисс отложено время, прошедшее после контакта животных с вирусом гриппа.

Справочник химика 21

Химия и химическая технология