Картирование с помощью ДНК-зондов

Позиционно-кандидатное картирование состоит в определении хромосомной локализации гена болезни, продукт которого неизвестен, и последующем анализе современных генетических и транскрипционных карт, с тем чтобы выявить кодирующие последовательности (гены, внутригенные EST), находящиеся в этом же районе (рис. 20.30). Весьма вероятно, что одна из этих последовательностей и окажется геном данного заболевания. Если какой-либо из генов-канди-датов охарактеризован, можно провести его мутационный анализ. Как альтернативу можно использовать кандидатные EST в качестве зондов, отобрать с их помощью геномный клон и секвенировать его, а затем также провести му- [c.476]

Картирование генов с помощью ДНК-зондов [c.308]

Методы картирования генов, обсуждавшиеся в предыдущих разделах, были основаны на экспрессии изучаемых генов в культурах клеток. Гены, кодирующие ферменты клеточного метаболизма, (табл. 18.2) и гены, кодирующие поверхностные антигены, такие, как белки главного комплекса гистосовместимости или антигены группы крови, удовлетворяют этому условию. Гены, не обладающие подобным фенотипическим проявлением, не могут быть картированы лищь с использованием описанных методов. Это ограничение удается преодолеть с помощью методов генной инженерии. При этом становится возможным картирование любых последовательностей ДНК, для которых можно получить соответствующий ДНК-зонд. Эти методы внесли поистине революционный переворот в генетический анализ гибридов соматических клеток. [c.308]

Рис. 20.25. Позиционное картирование. Идентификация гена, продукт которого неизвестен, с помощью хромосомного картирования и зондов, специфичных в отношении тесно сцепленных маркеров.

Появившиеся в последнее время методы позволяют составлять подробные карты очень больших геномов. Есть две категории карт 1. Физические карты, основывающиеся на строении молекул ДНК, составляющих каждую хромосому. Сюда относятся рестрикционные карты и систематизированные библиотеки клонов геномной ДНК. 2. Карты генетического сцепления их строят, основываясь на частоте совместной передачи потомству двух или нескольких признаков - генетических маркеров, различных у отца и матери и приписываемых определенному участку хромосомы. В качестве маркеров издавна принято использовать те гены, экспрессия которых обнаруживается по их эффекту (таковы, в частности, гены, вызывающие генетические болезни, например мышечную дистрофию). Разработанные сравнительно недавно новые методы с применением рекомбинантной ДНК дали возможность использовать в качестве генетических маркеров короткие последовательности ДНК, содержащие один из сайтов рестрикции и различающиеся у отдельных индивидуумов, такие последовательности особенно удобны для генетического картирования, потому что под действием рестрикционной нуклеазы возникают фрагменты, различающиеся по своей длине, и этот полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) легко может быть выявлен блот-анализом по Саузерну с помощью подходящего ДНК-зонда (рис. 5-90). [c.342]

Клонирование ряда генов человека позволило обнаружить полиморфизм по этим генам на основе использования рестрикционного анализа хромосомной ДНК. Различающиеся фрагменты ДНК, соответствующие данному гену или его участкам, выявляются при помощи электрофореза рестриктов и последующей гибридизации их с радиоактивным зондом — клонированным участком ДНК, по которому изучают полиморфизм. Такие зонды используют также для локализации генов непосредственно на препаратах хромосом. Объединение этого подхода с методом дифференциальной окраски дает возможность привязывать конкретные гены к участкам конкретных хромосом. Объединение генеалогического метода с цитогенетическим, а также с новейшими методами генной инженерии значительно ускорило процедуру картирования генов у человека. Карты хромосом человека представлены на рис. 20.9. [c.507]

Принцип этого метода прост. Рассмотрим его на конкретном примере картирования некоего фрагмента ДНК человека величиной 14,9 т.п.н., клонированного на фаговом векторе. Функция этого фрагмента ДНК не ясна. Известно, что он присутствует в количестве не более одной-двух копий на гаплоидный геном. Метафазные хромосомы человека, распределенные на стандартном предметном стекле, обрабатывали с целью удаления примесей связанной РНК и денатурации хромосомной ДНК. В качестве зонда использовали клонированный фрагмент ДНК, радиоактивно меченный ( Н) с помощью ник-трансляции. Пред- [c.314]

Картирование хромосом с помощью гибридизации. РНК-зонды или денатурированные ДНК-зонды [c.335]

Рис. 18.17. Картирование клонированных генов человека при использовании гибридов соматических клеток мыши и человека с помощью блот-гибридизации по Саузерну. Присутствие хромосом человека определяется при цитологическом изучении гибридных клеток. Ферменты, служащие маркерами данных хромосом, выявляются с помощью гель-электрофореза. Рестрикционные фрагменты ДНК, выделенной из гибридной линии, разделяют электрофорезом в агарозном геле и переносят на нитроцеллюлозный фильтр. На этом фильтре проводят их гибридизацию с зондом, меченным радиоактивными изотопами. (По Shows ТВ. et al, 1982. Adv. Hum. Genet., 12, 341-452.)

Часто при гибридизации к меченому зонду добавляют большой избыток (тысячекратный) немеченой конкурирующей ДНК (табл. 18.5). Этот прием уменьшает неспецифическое связывание зонда. В рассматриваемом примере в отсутствие конкурирующей ДНК (второй ряд табл. 18.5) в большей части клеток гибридизация с фрагментом 14,9 т.п.н. происходит в области 1р36, однако значительная часть черных точек на автографе, означающих гибридизацию, оказывается распределена и по многим другим хромосомным локусам. В этом случае могут выявляться последовательности человеческой ДНК, гибридизуюгциеся с зондом менее специфично. В таблице 18,6 приведены гены человека, картированные с помощью гибридизации in situ. [c.315]

Недавно сконструированы векторы, содержащие промоторы SP6, Т7 или ТЗ, непосредственно примыкающие к сайтам для клонирования ([8] и неопубликованные результаты). Это позволяет быстро и легко приготовить меченные згр РНК-зонды, специфичные в отношении концов клонированной ДНК и поэтому очень подходящие для использования в качестве зонде в для идентификации новых космид, вставки в которых перекрываются со вставкой в исходной космиде. Этот процесс выделения перекрывающихся клонов известен как прогулка по геному, причем использование промоторных систем SP6/T7/T3 может существенно уменьшить время и труд, затраченный на проведение такой прогулки , поскольку при этом отпадает необходимость в идентификации концов клонированных фрагментов с помощью рестрикционного картирования и физического выделения этих фрагментов для приготовления новых зондов. [c.65]

Очень полезно, а иногда и просто необходимо иметь рестрикционную карту такой клонированной вставки ДНК. Расположение сайтов рестрикции, особенно тех, что встречаются лишь 1—2 раза во всей плазмиде, можно определить при помощи стандартных методик рестрикционного картирования [24]. Для обоих типов одноцепочечных зондов необходимо иметь единичный сайт рестрикции в участке тестируемой ДНК, дистальном по отношению к сайту связывания с РНК-полимеразой в случае РНК-зондов (см. разд. 5.1) или с олигонуклеотидами в случае ДНК-зондов (см. разд. 6.3 и рис. 10). После реассоциации одноцепочечного меченого ДНК-зонда с тестируемой ДНК может возникнуть необходимость расщепить гибридную последовательность ДНК на 2—3 фрагмента с оптимальной для ДГГЭ длиной. В этом случае надо использовать сайты рестрикции, имеющиеся в тестируемом фрагменте. [c.141]

С целью выделения специфического зонда для прогулки вдоль хромосомы идентифицируют рестрикционный фрагмент, находящийся на конце вставки эукариотической ДНК. Такой фрагмент не должен содержать повторяющихся последовательностей ДНК- Это легко проверить путем гибридизации с суммарной ДНК мыши, используемой в качестве зонда для гибридизации по Саузерну. Этот зонд содержит космидную ДНК, гидролизованную различными ферментами (использованными для картирования). В нормальных условиях будут гибридизоваться лишь те рестрикционные фрагменты, которые содержат повторяющиеся последовательности ДНК (Steinmetz et al., 1980). Фрагменты, которые не гибридизуются и которые происходят из концевых областей вставки эукариотической ДНК, далее выделяют с помощью электрофореза в агарозном геле, используя один из многочисленных имеющихся методов (Maniatis et al.. [c.34]

Минисателлиты существуют в виде разбросанных по всему геному семейств, родство членов которых определяется гомологией с некоторой базовой последовательностью. Клонированный участки минисателлитов используют для приготовления зондов, с помощью которых при гибридизации в мягких условиях выявляют в геномной ДНК их множественные аллели. Один зонд с помощью блотинга по Саузерну позволяет наблюдать одновременно за наследованием нескольких десятков минисателлитов, расположенных в разных локусах, но относящихся к одному семейству. Ми-нисателлиты достаточно коротки, вследствие чего их длина в данном локусе относительно стабильна в ряду нескольких поколений. Поэтому они могут служить маркерами и позволяют проводить сегрегационный анализ и, кроме того, облегчают картирование сцепленных с ними генов. [c.296]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология