Субтилизины мутантные

Выбранные аминокислоты были локализованы в четырех разных областях белковой молекулы N-концевом участке (остатки со 2 по 5), в омега-петле (остатки с 36 по 44), в а-спираль-ной области (остатки с 63 по 85) и в одном из Р-слоев (остатки с 202 по 220). Чтобы идентифицировать оптимальную для данного сайта аминокислоту, мутантные клоны вырашивали в плашках, прогревали при 65 °С в течение 1 ч, охлаждали и измеряли активность субтилизина. Для синтеза активного, не связывающего кальций субтилизина пришлось использовать В. subtilis, поскольку для Е. соИ такой белок оказался токсичным. [c.173]

Предварительный анализ выявил наличие стабилизируюших мутаций в 7 из 10 исследованных сайтов (табл. 8.5). Фермент, полученный при их внесении в один ген, обладал кинетическими свойствами, сходными с таковыми исходного субтилизина. Кроме того, мутантный субтилизин в отсутствие кальция был почти в 10 раз более стабилен, чем исходный и, как это ни удивительно, примерно на 50% более стабилен, чем исходный фермент в присутствии кальция. Полученные результаты показывают, что несмотря на трудоемкость этих экспериментов с помошью генной инженерии можно изменять свойства ферментов, которые зависят от большого числа аминокислотных остатков. [c.173]

Первая контролируемая модификация белка была проведена в середине 60-х годов Кошландом и Бендером. Для замены гидроксильной группы на сульфгидрильную в активном центре протеазы — субтилизина они применили метод химической мо дификации. Однако, как выяснилось, такой тиолсубтилизин не сохраняет протеазную активность. Вообще говоря, методы химической модификации не только жестки и неспецифичны они плохи еще и тем, что с их помощью невозможно вызвать множественные желаемые изменения, особенно если модифицируемые аминокислотные остатки погружены в глубь третичной структуры белка. Для этого нужна белковая инженерия, основанная на генетической инженерии. Сегодня она осуществляется при помощи двух хорошо освоенных методов (гл. 7). Так, сайт-специфический мутагенез осуществляется следующим образом. Клонируют ген того белка, который интересует исследователя, и встраивают его в подх.одящий генетический носитель. Затем синтезируют олигонуклеотидную затравку с желаемой мутацией, последовательность которой из десяти — пятнадцати нуклеотидов в достаточной степени гомологична определенному участку природного гена и поэтому способна образовывать с ним гибридную структуру. Эта синтетическая затравка используется полимеразами для начала синтеза комплементарной копии вектора, которую затем отделяют от оригинала и используют для контролируемого синтеза мутантного белка. Альтернативный подход основан на расщеплении цепи, удалении подлежащего изменению сайта и замещении его синтетическим аналогом с желаемой последовательностью нуклеотидов. [c.183]

Импринтинг субтилизина ( arlsberg и мутантных форм) сахарозой, а также тимидином и другими нуклеозидами [c.456]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология