Субтилизины, активные центры

С другой стороны, известны молекулы белков, которые резко отличаются друг от друга первичной, вторичной и третичной структурами, но несмотря на это, обладают сходной биологической активностью. Классическим примером могут служить химотрипсин и бактериальная протеиназа субтилизин. Несмотря на существенные различия в структурах, основные аминокислоты активных центров этих ферментов идентичны и осуществляют свои каталитические функции по сходному механизму. По-видимому, такие белки являются результатом пересечения путей эволюции. [c.282]

Увеличение резистентности антитела к протеолизу в присутствии гаптена продемонстрировано также на других моделях с использованием как химотрипсина, так и субтилизина. Показано, что гаптен влияет на чувствительность к протеолизу именно РаЬ-фрагмента, более точно участки расщепления не были локализованы. Полученные результаты интерпретируют как доказательство изменения конформации активного центра под влиянием гаптена и стабилизации конформации участка молекулы антитела, содержащего антидетерминанту. [c.103]

Обсуждаемый комбинированный подход к модификации белков может быть использован для изменения окружения активного центра ферментов, исследования топологических особенностей белковых молекул и их стабилизации. В частности, с помощью этой группы методов удается манипулировать активностью, специфичностью и рН-оптимумом субтилизина, а также конструировать комбинаторные клонотеки белков, в которых исследуемая полипептидная цепь целенаправленно сканируется остатком ys [44]. [c.306]

Аргументом в пользу орбитального управления Сторм и Кошланд [18] считают, что в ряду соединений XI—XIV при замене атома О на 8 происходит сильное изменение порядка расположения этих соединений по их реакционной способности. Относительные скорости образования соответствующих тиолакто-нов XI XII XIII XIV = 70 115 2,5- 10 427 (ср. с данными табл. 13). В ферментативных системах замена ОН-группы серина активного центра на 8Н-группу также приводит к значительному изменению скорости. Например, такая модификация субтилизина вызывает сильное уменьшение активности фермента [22]. Подобные аргументы, однако, нельзя считать вполне обоснованными. Замена О на 5 сопровождается не только небольшими изменениями в геометрии системы (что считается в [18] основным следствием такой замены), но также значительными изменениями в электронном строении. Известно, например, что [c.79]

В 1958 г. Ф. Ричардс показал, что в определенных условиях субтилизин расщепляет в РНКазе пептидную саязь А1а-20— Ser-2l. Образующиеся фрагменты были названы S-пептидом (остатки 1 — 20) и S-белком (остатки 21 — 124) за счет нековалентных взаимодействий фрагменты образуют комплекс, названный РНКазой S. Этот комплекс обладает почти полной каталитической активностью нативного фермента в изолированном виде S-пептид и S-белок неактивны. Далее было установлено, что синтетический пептид, идентичный по последовательности фрагменту S-пептида, содержащему остатки с 1 по 13, восстанавливает активность S-белка, однако более короткий пептид, содержащий остатки с 1 по II, такой способностью не обладает. Полученные данные позволили сделать заключение о токГ, что соответствующие остатки His-12 или Met-13 (или оба этих остатка) входят в активный центр ферменту. [c.194]

Первая контролируемая модификация белка была проведена в середине 60-х годов Кошландом и Бендером. Для замены гидроксильной группы на сульфгидрильную в активном центре протеазы — субтилизина они применили метод химической мо дификации. Однако, как выяснилось, такой тиолсубтилизин не сохраняет протеазную активность. Вообще говоря, методы химической модификации не только жестки и неспецифичны они плохи еще и тем, что с их помощью невозможно вызвать множественные желаемые изменения, особенно если модифицируемые аминокислотные остатки погружены в глубь третичной структуры белка. Для этого нужна белковая инженерия, основанная на генетической инженерии. Сегодня она осуществляется при помощи двух хорошо освоенных методов (гл. 7). Так, сайт-специфический мутагенез осуществляется следующим образом. Клонируют ген того белка, который интересует исследователя, и встраивают его в подх.одящий генетический носитель. Затем синтезируют олигонуклеотидную затравку с желаемой мутацией, последовательность которой из десяти — пятнадцати нуклеотидов в достаточной степени гомологична определенному участку природного гена и поэтому способна образовывать с ним гибридную структуру. Эта синтетическая затравка используется полимеразами для начала синтеза комплементарной копии вектора, которую затем отделяют от оригинала и используют для контролируемого синтеза мутантного белка. Альтернативный подход основан на расщеплении цепи, удалении подлежащего изменению сайта и замещении его синтетическим аналогом с желаемой последовательностью нуклеотидов. [c.183]

Рис. 2.3. Схема строения сериновых нротеаз тина трипсина (а) и субтилизина б). Активные центры ферментов изображены в виде треугольников

Известны также случаи конвергентной эволюции, хотя, по-видимому, они встречаются значительно реже. Бактериальная протеиназа субтилизин имеет совершенно отличную от протеи-наз млекопитающих трехмерную структуру, однако активный центр у этих ферментов одинаков —в него входит сериновая система с переносом заряда, от которой зависит катализ (см. также с. 750). Фруктозобисфосфат-альдолаза, по-видимому,, представлена двумя разными классами белков, имеющих в. Списке ферментов один и тот же номер — 4.1.2.13. Фермент класса I катализирует альдольное расщепление, которое протекает с образованием в качестве промежуточного продукта шиффова основания с остатком лизина активного центра, в то-время как фермент класса II нечувствителен к боргидриду (реагенту на присутствие шиффова основания), а в качестве-простетической группы содержит металл. Ферменты класса I распространены у высших организмов, а класса II —у бактерий и грибов, но имеются данные, что Е. oli и некоторые одноклеточные зеленые водоросли содержат ферменты обоих типов. Оба этих класса ферментов сходны только специфичностью, а в остальном они мало похожи друг на друга более того, метал-лоферменты бактерий и грибов тоже различаются [1952, 2042]. [c.105]

Наиболее широко этот метод был использован для исследования субтилизина с целью получения ферлента, устойчивого к окислению [2111З и к тепловой денатурации [2112-21153, для изменения рН-оптимума фермента [21161, выяснения роли отдельных остатков в области активного центра в специфичности фермента [2117-212- 3 и, наконец, для подтверждения механизма стабилизации переходно- Х> состояния [21223. [c.198]

Структурные различия комплексов EL и EL в большинстве случаев остаются неясными. Так, при взаимодействии субтилизина с арилборными кислотами име ются обоснованные данные [28641 о том, что первый комплекс является сорбционным, тогда как второй - продукт oлLобразования борнокислого остатка и гидроксильной группы серина активного центра [c.277]

Использование химических методов для направленного изменения свойств ферментов, по-видимому, началось в 1966 г. с работ Л. Полгара и М. Бендера [145], а также К. Ниита и Д. Кош-ланда [146], которые применили своеобразный химический мутагенез на уровне белковой молекулы для превращения остатка Ser в ys в каталитической триаде активного центра субтилизина. Интерес к этому направлению исследований был стимулирован во второй половине 1980-х гг. опытами Е. Кайзера, в частности, присоединившего флавиновый кофермент к папаину, что привело к превращению протеиназы в оксидоредуктазу [147]. Сегодня ковалентные и нековалентные химические модификации белковых молекул являются широко распространенным подходом к изменению их свойств [148]. Ниже будут кратко рассмотрены три современных подхода к улучшению свойств ферментов разными химическими методами. [c.369]

При исследовании структуры ферментов в органических средах было установлено, что кристаллические или лиофильно высушенные полипептиды сохраняют свои основные характерные особенности. Так, с помощью рентгеноструктурного анализа кристаллов субтилизина, содержащих небольшое количество поперечных сшивок, было продемонстрировано, что фермент в таких условиях не изменяет свою общую структуру, а структура активного центра практически не отличается от таковой в водных растворах и других органических растворителях [155]. Похожие данные были получены и с помощью инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье (FTIR spe tros opy) [156]. На основании таких результатов были сделаны выводы о независимости свойств ферментов как биокатализаторов от природы органических растворителей. Несмотря на то, что способность ферментов к катализу зависит от состава среды, эту зависимость нельзя объяснить изменениз1ми их структуры. В отличие от кристаллических и лиофильно высушенных форм, у ферментов, находящихся в растворе, наблюдалось изменение вторичной структуры, которое зависело от природы использованного органического соединения и коррелировало с изменениями уровней ферментативной активности растворенных белков. Особенно сильная потеря активности имеет место при значительном отклонении структуры а-спиральных участков и (3-слоев ферментов от таковой, наблюдаемой в водных растворах. [c.372]

Подходы, основанные на химической белковой инженерии, также дают возможность оказывать весьма существенное влияние на субстратную специфичность ферментов. В результате реализации таких подходов удается сочетать высокую избирательность катализа, которую обеспечивает полипептидная цепь, с каталитической универсальностью синтетических активных центров. Эффективность применения данной группы методов иллюстрируют результаты, полученные с классическим объектом белковой инженерии - сериновой протеиназой субтилизином [318]. Фермент был закристаллизован и непосредственно в кристаллическом состоянии стабилизирован поперечными сшивками с помощью глутарового альдегида. В таком состоянии субтилизин оказался нерастворимым в воде и органических растворителях, и демонстрировал очень высокий уровень стабильности. Далее остаток Ser-221, находящийся в активном центре субтилизина, был превращен химическими методами в производное селеноцистеи- [c.441]

ДИФ-химотрипсин совершенно не активен. Поскольку нз 28 остатков серина с реагентом взаимодействует только один остаток (серин-195), а утративший активность в результате тепловой денатурации химотрипсин вообще не модифицируется реагентом, сделано заключение, что серин-195 находится в активном центре. Все так называемые сериновые протеиназы (табл. 6.4), образующие промежуточные ковалентные соединения (ацилферменты), также реагируют с ДИФФ анализ последовательности аминокислот в инактивированных с помощью ДИФФ ферментах показал, что остаток реактивного серина находится во фрагменте, имеющем у всех этих ферментов идентичную (или очень сходную) последовательность. Одна и та же последовательность Gly—Asp— Ser-P—Gly—Gly—Pro имеется в химотрипсине, трипсине, эласта-зе, тромбине и плазмине, однако у субтилизина последовательность аминокислот, включающая реактивный остаток серина, другая. Высокая реакционная способность модифицируемых остатков серина является следствием их уникального окружения в активных центрах соответствующих ферментов. [c.299]

Субтилизин - это также серииовая протеиназа. Однако последовательности аминокислот в химотрипсине и субтилизине совершенно различны, что указывает на их независимое появление в процессе эволюции. Например, в молекуле химотрипсина имеется пять дисульфидных мостиков, тогда как в субтилизине-ни одного. Последовательность аминокислот вокруг серина в активном центре субтилизина и химотрипсина имеет следующий вид [c.164]

Субтнлизин, сериновая протеаза бактериального происхождения, также проявляет, подобно а-химотрипсину, обращенную специфичность к D-K TI [103]. Это предполагает, что оба фермента обладают сходной специфичностью к конфигурации их субстратов. Такая общая специфичность ясно подтверждает близкую структурную аналогию первичных связывающих центров обоих ферментов, и, более того, она отражает эту аналогию. Близкая структурная аналогия объясняет, каким образом а-химотрипсин и субтилизин, имеющие абсолютно разное филогенетическое происхождение, в действительности замораживают свои субстраты в одинаковой активной конформации. [c.234]

I протеиназой субтилизином, происходит расщепление фермента на два крупных полипептида, один из которых проявляет 5 3 экзонуклеазную активность, а другой содержит каталитический центр полимеризации. Последний фрагмент (известный как фрагмент Клёнова) сохраняет полимеразную активность и может быть полностью очищен от примеси 5 -> -> З -экзонуклеазного фрагмента. [c.116]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология