Фосфат кальция при трансфекции

Исходя из нашего опыта, можно заключить, что результаты трансфекции воспроизводимы. В некоторых случаях может оказаться необходимым оптимизировать условия шока , варьируя концентрацию глицерина и время инкубации. Обсуждение способа трансфекции с помощью осаждения фосфатом кальци приводится в разд. 6. [c.26]

Трансфекция ДНК с использованием фосфата кальция [c.27]

На примере ДНК вируса простого герпеса показано, что сразу после соосаждения с фосфатом кальция вирусная ДНК становится устойчивой к разрушению ультразвуком, но комплекс фосфат кальция - ДНК остается чувствительным к ДНКазе в течение 4 ч. При взаимодействии этого комплекса с культурой клеток животных ДНК становится устойчивой к ДНКазе уже в течение первого часа. Дальнейшие исследования показали, что ДНК образует с фосфатом кальция прочный комплекс, который при оптимальных условиях поглощают практически все реципиентные клетки. Эффективность поглощения клетками комплекса фосфат кальция - ДНК в значительной степени зависит от pH, при котором формировался этот комплекс, и концентрации ДНК. Важно, чтобы осадок фосфата кальция получился мелкодисперсным. Но даже в оптимальных условиях проведения трансфекции данным методом лишь в 1-5 % клеток комплекс достигает ядра. По-видимому, проникновение ДНК из цитоплазмы в ядро является критическим этапом, наиболее сильно влияющим на эффективность трансфекции клеток вирусной ДНК. Электрон-но-микроскопическая визуализация позволила сделать заключение, что микрокристаллы комплекса фосфат кальция - ДНК проникают в клет- [c.333]

Для трансформации дрожжей обычно используют три способа. В первом случае экзогенную ДНК добавляют к клеткам дрожжей, клеточные стенки которых удалены химически или энзиматически (протопласты) (1). В других случаях клетки перед добавлением чужеродной ДНК обрабатывают ацетатом лития (2) или подвергают электропорации (3). Трансфекцию культур животных клеток осуществляют инкубацией клеток с ДНК, осажденной фосфатом кальция или ДЕАЕ-декстраном (1), либо электропорацией в присутствии очищенной трансфицирующей ДНК (2). Как уже упоминалось в гл. [c.136]

Опыты с ДНК, выделенной из клеток опухолей, также свидетельствуют о существовании онкогенов. Метод обнаружения клеточных онкогенов получил название переноса геиов или трансфекции . Он основан на том, что некоторые гены, присутствующие в опухолевых клетках, могут вызывать трансформацию нормальных клеток в культуре. Из опухолевых клеток выделяют ДНК, осаждают фосфатом кальция и добавляют к клеткам-реципиентам (обычно в этой роли выступает линия мыщиных фибробластов NIH/3T3). Через 1—2 недели под микроскопом наблюдают образование фокусов трансформации. Клетки, составляющие фокус, меняют свою морфологию из распластанных они становятся округленными. Из трансформированных клеток выделяют ДНК, и опыт повторяют. Так делают несколько раз, при этом уменьшается количество ДНК, не участвующей в переносе признака трансформации, и, следовательно, облегчается идентификация специфических генов (при помощи гибридизации по Саузерну (см. гл. 36)). С помощью этого метода было идентифицировано около 20 клеточных онкогенов некоторые из них сходны с геном ras вируса саркомы мыщей. Эти клеточные онкогены либо вообще не отличаются от нормальных генов, либо имеют небольшие структурные особенности (см. ниже). В первом случае при опухолевом перерождении может меняться регуляция их экспрессии. [c.359]

Поэтому Ф. Грэхем и А. ван дер Эб нанесли на монослой клеток КВ, предварительно обработанных ДЭАЭ-декстраном, ДНК аденовируса Ad5 в растворе СаС1г. При этом эффективность трансфекции удалось повысить в 10-100 раз. В дальнейшем выяснили, что аналогичные результаты получаются, когда клетки не обрабатывают ДЭАЭ-декстраном. Поскольку, в питательной среде присутствовали фосфаты, при добавлении раствора хлорида кальция образовывался осадок фосфата кальция. Удаление этого осадка из среды приводило к потере инфекционности ДНК. В результате проведенных затем экспериментов стало ясно, что трансфекция происходит в результате соосаждения вирусной ДНК и образующихся микрокристаллов фосфата кальция на клеточный монослой. [c.333]

Кальций-фосфатный метод обычно более эффективен, чем ДЭАЭ-декстрановый, при трансфекции линейными вирусными ДНК и заметно уступает последнему при использовании кольцевых молекул ДНК. Вероятно, образование микрокристаллов фосфата кальция и соосажде-ние с ними молекул ДНК сопровождается нарушением структуры части этих макромолекул. Особенно да1шый эффект сказывается на лабильных кольцевых молекулах ДНК, которые после разрыва цепей и перехода в линейную форму уже не инфекционны. ДЭАЭ-декстрановый метод, как более мягкий, обеспечивает значительно ббльшую эффективность проникновения кольцевых молекул ДНК в клетки животных в неповрежденном виде, хотя в целом доля клеток, поглотивших ДНК при обработке ДЭАЭ-декстраном, существенно меньше, чем при трансфекции кальций-фосфатным методом. [c.334]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология