Нуклеотидная последовательность этидием

Рис. 9.6. Электрофоретический анализ ре- -стрикционных фрагментов ДНК. ДНК фага X инкубировали с различными указанными на рисунке рестриктазами время, достаточное Для того, чтобы во всех чувствительных сайтах произошло расщепление нуклеотидной последовательности. Образовавшуюся смесь фрагментов ДНК подвергали электрофорезу в агарозном геле. Полосы идентифицировали в ультрафиолетовом свете после окрашивания геля бромистым этидием. Стартовые точки обозначены жирными стрелками. Интактная ДНК фага X представляет собой линейную молекулу длиной около 48 500 н. п. При действии рестриктазы ВдШ возникают фрагменты длиной 22800,

Рестрикционные эндонуклеазы П-го типа являются гидрола-зами, специфически взаимодействующими с определенными короткими нуклеотидными последовательностями двухцепочечной ДНК и расщепляющими фосфодиэфирную связь в определенном месте относительно участка узнавания. Несмотря на то, что в настоящее время известно более 1000 рестриктаз, и более ста среди них широко используются в качестве аналитических реагентов, кинетика и механизм реакций катализируемых этими ферментами изучены недостаточно. С чем это связано Во-первых, в большинстве экспериментов обычно используется избыток эндонуклеазы рестрикции, чтобы обеспечить полное расщепление ДНК, поэтому не требуется знания определенных кинетических параметров фермента. Во-вторых, для изучения кинетики реакций ДНК с эндонуклеазами рестрикции, используются довольно сложные и относительно длительные количественные методы регистрации каталитической активности рестриктаз, например, разделение рестрикционных фралментов ДНК электрофорезом в агарозном или полиакриламидном геле с последующим определением относительного количества продуктов УФ-сканированием геля, окрашенного бромистым этидием (или фотонегатива этого геля) или подсчетом радиоактивности фрагментов при использовании меченной ДНК (разд. 1, часть II). [c.68]

Если сайт для какой-то рестриктирующей эндонуклеазы находится в каждом из повторов тандемного кластера, то такой кластер расщепляется на фрагменты, длина которых равна длине повторяющейся единицы (рис. 9.26,/4). При гель-электрофорезе суммарной геномной ДНК, окрашенной бромистым этидием, набор этих фрагментов одинаковой длины очень часто образует отдельную полосу. ДНК, элюированную из этой полосы, можно сразу подвергнуть предварительному секвенированию. Полученная таким образом каноническая консенсусная последовательность не обязательно соответствует последовательности любой из повторяющихся единиц, поскольку, как мы уже говорили, такие единицы в центромерных тандемных повторах редко бывают идентичными. Обычно они образуют семейство, члены которого отличаются друг от друга одним или более нуклеотидным остатком. Некоторые из них дивергировали в результате случайных нуклеотидных замен. Иногда нуклеотидные замены обнаруживаются сразу в нескольких или во всех единицах какой-то части кластера. Если часть кластера существенно отличается от сателлитной последовательности в целом, то говорят о субкластере или о сателлитном домене. Секвенирование клонированных сателлитных повторов, доменов и мономерных повторяющихся единиц показало, что то, что раньще представлялось совершенно гомогенной последовательностью, на самом деле есть совокупность в значительной степени различающихся единиц. [c.189]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология